肝豆灵干预铜负荷大鼠肾损伤的代谢组学研究*

目的〓分析肝豆灵对铜负荷大鼠肾损伤的代谢组学影响,探讨肝豆灵的肾脏排铜机制。方法〓实验大鼠被随机分为正常组、模型组和肝豆灵组。造模结束后,以TUNEL法测肾小管上皮细胞凋亡,核磁共振技术结合偏最小二乘判别分析法分析大鼠肾组织小分子代谢物。结果〓与正常组比较,模型组肾小管上皮细胞凋亡指数升高（P<0.01）;苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、肌苷、天冬氨酸含量降低。与模型组相比,肝豆灵组肾小管上皮细胞凋亡指数降低（P<0.01）;苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、肌苷、天冬氨酸含量升高。结论〓肝豆灵对铜负荷大鼠肾损伤具有一定的干预作用,其机制可能涉及对芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸）、支链氨基酸（亮氨酸、缬氨酸）的调节;抑制肾小管上皮细胞凋亡、调节肾脏氨的代谢。     

肝豆灵对高铜负荷小鼠神经干细胞活性氧水平及核因子E2相关因子2表达的影响

目的观察肝豆灵对高铜负荷小鼠神经干细胞内活性氧(ROS)水平及核因子E2相关因子2(Nrf2)m RNA及蛋白表达的影响。方法体外培养高铜负荷小鼠神经干细胞模型。实验小鼠随机分为空白对照组、模型组和肝豆灵低、中、高剂量组,各给药组给予相应浓度肝豆灵药物血清灌胃。采用MTT法检测神经干细胞增殖水平,流氏细胞仪检测细胞内ROS水平,q RT-PCR检测Nrf2基金表达,Western blot检测细胞内Nrf2蛋白表达。结果与空白对照组比较,模型组小鼠神经干细胞增殖率显著下降,ROS水平明显升高,Nrf2基因、蛋白表达明显降低(P0.01);与模型组比较,肝豆灵各剂量组小鼠神经干细胞增殖率显著升高,ROS水平明显降低,Nrf2基因、蛋白表达明显升高(P0.05,P0.01)。结论肝豆灵通过降低高铜负荷小鼠ROS含量、上调Nrf2的表达,从而促进小鼠神经干细胞的增殖。     

代谢组学应用于中医药研究的思考

代谢组学是关于生物体内源性代谢物质种类、数量及其变化规律的学科。本论文在分析国内外有关代谢组学应用于中医药研究的文献基础上,探讨代谢组学与中医证候、中医整体观、中药质量标准化研究、中药的活性成分的研究以及中药方剂研究的关系,认为代谢组学能够以现代化的科技手段实现对活体组织器官进行无损伤、几乎接近生理条件的动态研究,这种研究特点与中医学的整体观、系统观和辨证论治思维相吻合,与中医认识和解释疾病的方法相一致;采用系统生物学的策略和方法,以基于疾病和药物干预下的系统代谢网络的整体性和动态性的变化来评价中药整体效应,用以解释中药方剂对疾病的治疗作用,使得代谢组学成为中药现代化研究中一个非常合适的方法。代谢组学将会是中医药现代化研究较为合适的切入点而且非常有用的技术手段。     

肝豆状核变性患者ATP7B基因8、12号外显子突变的DNA分析

目的 对肝豆状核变性(Wilson disease,WD)ATP7B基因的外显子8、12进行DNA测序分析并建立直接基因诊断方法.方法 102例WD患者和82例对照正常人提取基因组DNA,PCR扩增ATP7B第8、12号外显子,8号外显子及12号外显子扩增产物分别行Msp Ⅰ及Tail内切酶酶切分析;后对所有患者及对照组DNA外显子扩增产物行直接测序.结果 102例WD患者,8号外显子35例存在Msp Ⅰ酶切反应异常,测序示Arg778Leu纯合或杂合突变(占34.31%),其中12例伴Leu770Leu多态性;12号外显子13例存在Tail酶切反应异常,测序示Thr935Met杂合错义突变(占12.75%),1例存在Argg19Gly杂合错义突变,Arg952Lys在患者及对照组中均检出.结论ATPTB基因外显子8、12为WD突变热点,其中8号外显子以Arg778Leu、12号外显子以Thr935Met为主要突变形式,临床上可用PCR-Msp Ⅰ酶切、PCR-Tail酶切反应作为WD患者初步筛选方法.     

基于NMR技术对Wilson病模型大鼠尿液的代谢组学研究简

目的：以基于核磁共振（NuclearMagneticResonance,NMR）的代谢组学方法对Wilson病（Wilson’sDisea峨WD）铜负荷模型大鼠及正常对照组大鼠的尿液进行研究,分析模型大鼠尿液中代谢物的变化,继而从小分子层面探讨铜过量对机体的损伤机制,以更加清楚的认识本病。方法：28只雄性wistar大鼠,体重（180±20）g,随机被分为模型组（n=14）和健康对照组（n=14）。采用铜负荷法制作wilson病大鼠模型,以NMR技术对大鼠尿液进行检测。采用MestRe—c2．3软件及自编软件对谱图进行手动调相、基线校正和谱峰对齐。对样品进行分段积分．将积分数据归一化后构成数据矩阵,并利用PCA方法对数据矩阵进行统计分析。结果：相对于正常对照组,模型组大鼠尿液醋酸盐（acetate）含量有显著升高,柠檬酸盐（citrate）、苯乙酰甘氨酸（PAG）、琥珀酸盐（succinate）、甲胺（methvlamine）、肌氨酸＋肌氨酸酐（creatine／creatinine）、丙酮酸盐（pyruvate）、二甲基甘氨酸（DMG）、丙氨酸（alanine）含量有所升高,胆碱（choline）、牛磺酸（taurine）含量有所降低。这些发生改变的代谢物可能是潜在的WD铜负荷小分子代谢标志物,可为进一步研究WD的铜过量代谢机制提供参考。     

WD患者ATP7B基因exon8 DNA突变检测方法的研究

目的对肝豆状核变性(又称Wilson病,WD)ATP7B基因的突变热点外显子8进行PCR扩增产物Msp I酶切和电泳分析及DNA直接双向测序,进而对实验中的方法进行优化研究。方法对102例患者和20例健康人提取基因组DNA,PCR扩增ATP7B基因第8号外显子,扩增产物进行Msp I酶切反应,并进行DNA直接双向测序;讨论分析改进PCR扩增、Msp I酶切的方法学,并对测序结果与临床表型做相关性研究。结果102例WD患者,用反复多次改进的实验方法研究分析后,发现35例存在Msp I酶切结果异常并经测序证实,8号外显子Arg778Leu纯合突变占所有WD病人的34.31%,其中1例伴Leu770Leu多态性同义突变;对照组未检出突变。结论改进实验方法后发现PCR扩增良好,适宜测序;WD突变热点8号外显子中Arg778Leu为主要突变形式,PCR-Msp I酶切反应可作为WD病人ATP7B8号外显子Arg778Leu突变的筛选方法,直接双向测序是确定8号外显子突变位点的可靠方法之一。     

新安固本培元派

正新安医学作为地域性综合性学术流派,内部分支学术流派林立,固本培元派就是其中学术阵容强大、历史悠久、特色鲜明的一支。在明初中期的16世纪,从汪机的人参、白术、黄芪和营卫、温补脾胃阳气,到其再传弟子孙一奎以温补下元为重,或合干姜、附子固先后天之本、培脾肾元气并举并治,以汪机众多的弟子门生们为主体的新安固本培元治法学派蔚然形成;此后明清众多的新安名医,包括当时闻名遐迩的歙西槐塘-冯塘程系、歙西余系、歙西澄溏吴系、休宁汪系等新安世医家族链医家,均连续不断地加入这一阵容,并在各自的临床实践中不断地丰富和发展温补培元之治,逐渐形成了以固本培元为学术主张,温养气血、培补脾肾元气为治法,临床善用人参、白术、黄芪或合干姜、附子     

帕金森病Parkin,LRRK 2基因序列变异研究

目的 探讨散发性早发性帕金森病患者遗传易感基因突变的形式和分布及易感基因突变在PD发病中的可能作用.方法 病例组由23例散发性早发帕金森患者组成,10例对照组.以基因组DNA为模板,扩增Parkin基因的第1、4、6号外显子和LRRK 2基因的第31号外显子.观察PCR产物测序后的突变情况.结果 发现样本中存在突变以及单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP).在一例患者Parkin基因Exon6上发现735ntT→C,对应的密码子TGT212CGT,翻译的氨基酸C212R,国内罕有报道.另一例患者Parkin基因Exon6上发现突变833ntG→C,导致第244密码子同义突变.结论 Parkin基因外显子4、6的突变可能是我国散发性早发PD患者的致病原因之一.     

肝豆状核变性基因8号外显子突变DNA分析方法的研究

目的对肝豆状核变性(又称Wilson病,WD)基因的突变热点外显子8进行MspⅠ酶切、DNA测序,进而对实验中的方法进行研究.方法对102 例病人和20例对照正常人提取基因组DNA,PCR扩增ATP7B第8号外显子,扩增产物进行MspⅠ酶切反应,并进行双向 DNA直接测序;讨论分析PCR扩增、MspⅠ酶切方法学上的改进,并对测序结果与临床表型做相关研究.结果102例WD病人,在反复多次改进实验方法后,发现35例存在MspⅠ酶切异常,测序示8号外显子Arg778Leu纯合突变,占所有WD病人的34.31%,其中 1例伴Leu770Leu多态性;对照组未检出突变.结论改进实验方法后发现WD突变热点8号外显子中Arg778Leu为主要突变形式,PCR-MspⅠ酶切反应可作为WD病人ATP7B8号外显子突变的筛选方法,直接测序是确定8号外显子突变位点的可靠方法.     

肝豆灵片治疗肝豆状核变性痰瘀互结证的疗效观察

目的:观察肝豆灵片治疗肝豆状核变性痰瘀互结证的疗效,并探讨其作用机制。方法:将76例肝豆状核变性痰瘀互结证患者随机分为对照组和观察组,各38例,两组均给予西医基础治疗[二巯基丙磺酸钠(DMPS)和葡萄糖酸锌片],观察组加用肝豆灵片,治疗6个疗程后观察两者临床疗效。观察治疗前后两组中医证候积分,改良Goldstein分级,24 h尿铜(urine copper,u-Cu),游离铜(non-ceruloplasmin plasma copper,nCP-Cu)水平、肝功能和血常规等指标。结果:中医证候疗效总有效率对照组为60.53%,观察组为81.58%,观察组优于对照组(P0.01)。临床疗效总有效率对照组为73.68%,观察组为84.21%,观察组优于对照组(P0.05)。与治疗前比较,治疗后两组患者n CP-Cu水平明显降低(P0.05),u-Cu水平显著升高(P0.01);治疗后两组无统计学差异。与治疗前比较,两组患者血清总胆红素(total bilirubin,TBIL),天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)和丙氨酸氨基转移酶(alanine amino-transferase,ALT)水平显著降低(P0.01);治疗后与对照组比较,观察组TBIL,AST和ALT水平明显降低(P0.05)。结论:肝豆灵片能显著改善肝豆状核变性痰瘀互结证患者中医证候,提高临床疗效,同时改善肝功能,且安全性高。