慢病毒载体介导IL-4基因修饰BMSCs内耳局部应用治疗免疫性感音神经性聋的实验研究

目的:探讨白细胞介素4(IL-4)基因修饰骨髓间充质干细胞(BMSCs)内耳局部植入对免疫性感音神经性聋动物内耳病理损伤和生理功能障碍的调节与治疗作用.方法:采用钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)抗原在已致敏的豚鼠圆窗龛局部免疫,造成免疫性感音神经性聋动物模型33只.分为IL-4基因修饰BMSCs组(A组)、空载慢病毒感染的BMSCs对照组(B组,即BMSCs空载对照组)和模拟手术对照组(C组),均将BMSCs细胞悬液经鼓阶开窗植入内耳. 提取豚鼠BMSCs,重组IL-4基因的慢病毒载体体外转染BMSCs,成功后鼓阶开窗植入内耳.采用免疫荧光组织化学法和免疫酶组织化学法 分别观察导入内耳的BMSCs 及IL-4基因产物在内耳组织结构中的分布和表达情况.应用酶联免疫吸附试验(ELISA)和听性脑干诱发电位(ABR)测试观察血清抗KLH特异性抗体水平和听觉功能变化,并行内耳石蜡切片光镜观察.结果:局部KLH免疫后与内耳局部BMSCs植入后2周,特异性抗KLH抗体水平差异无统计学意义;A组和B组ABR Ⅲ波阈值不同程度降低,但前者阈值降低更为明显,两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).免疫组织化学结果显示BMSCs(荧光反应阳性细胞)主要分布在鼓阶、前庭阶,酶反应阳性(IL-4基因产物)部位主要集中于螺旋神经节、骨螺旋板唇部、Corti器、血管纹、耳蜗骨壁以及蜗管中的BMSCs的细胞和其周围.内耳光镜观察结果显示:A组和B组仅在鼓阶内有絮状物,注射部位有少量红细胞和白细胞;C组可见螺旋神经节和蜗轴小血管周围有单个核细胞浸润,部分听损耳还可见螺旋神经节细胞数目减少、不同程度的膜迷路积水、蜗管内有絮状物和漂浮细胞. 结论:重组IL-4基因的慢病毒载体植入内耳后,可在内耳迁移并产生基因产物IL-4.经IL-4基因修饰的BMSCs和空载在体外成功地转染BMSCs.经鼓阶途径BMSCs内耳移植均可明显减轻免疫性感音 神经性聋动物的内耳免疫炎症反应和听觉功能损伤,前者作用更为显著.从而提示BMSCs(包括经IL-4基因修饰的BMSCs)局部应用可对免疫性内耳病的免疫炎症损伤产生一定的调节和治疗作用,并有向病变部位迁移、聚集的倾向.     

IL-10基因内耳局部治疗自身免疫性感音神经性聋的实验研究

目的:探索局部应用IL-10基因与慢病毒重组载体对实验性自身免疫性感音神经性聋(ASNHL)的治疗作用。方法:采用纯化同种内耳抗原免疫豚鼠,造成ASNHL动物模型,再将重组载体分别经鼓阶、内淋巴囊和圆窗龛局部注射或渗透,观察听觉功能和内耳病理形态学变化,同时行免疫组织化学试验了解慢病毒转染和基因产物在内耳的分布。结果:治疗前后ABRⅢ波阈值的均值对比分析结果显示,各实验组局部基因治疗后均降低;治疗后各实验组组间比较差异无统计学意义。慢病毒主要转染部位是血管纹、Corti器、蜗轴小血管周围及其内淋巴囊等处。基因产物表达部位与转染部位基本相同。结论:重组载体经不同途径均可转导入内耳,并在内耳表达基因产物,对ASNHL发挥有效的治疗作用。     

豚鼠自身免疫性梅尼埃病相关抗原相对分子质量68000蛋白的二维电泳和质谱分析

目的:探寻导致豚鼠自身免疫性梅尼埃病模型的内耳组织抗原成分中相对分子质量为68 000的蛋白质成分.方法:双向凝胶电泳方法分离豚鼠内耳组织抗原成分,用ImageMaster图像分析软件选择相对分子质量为68 000的蛋白质点,对这些蛋白质点进行质谱分析,通过Mascot软件查询Swiss-prot数据库,利用PathwayStudio软件对查询到的蛋白进行生物信息学分析并选取蛋白进行免疫印迹法验证.结果:获得重复性和分辨率都较好的双向电泳图谱,软件分析相对分子质量为68 000蛋白共获得22个蛋白质点;质谱分析后查询数据库鉴定得到13个蛋白质.这些蛋白分别与免疫、凋亡和分化等功能相关,其中波形蛋白从相对分子质量、Mascot评分和蛋白功能等方面综合评估可能为相对分子质量 68 000蛋白中引起豚鼠自身免疫性梅尼埃病的主要蛋白.结论:成功获得豚鼠自身免疫性梅尼埃病模型主要内耳抗原成分中相对分子质量 68 000 蛋白的双向凝胶电泳图谱,并应用质谱技术鉴定蛋白质点.波形蛋白可能为相对分子质量 68 000 蛋白中引起豚鼠自身免疫性梅尼埃病的主要蛋白.