RNAi沉默MCM7基因对人肝癌细胞SMMC-7721裸鼠移植瘤影响研究

目的探讨微小染色体维持蛋白7(miniehromosome maintenanceprotein7,MCM7)基因RNAi(RNA interference)的重组慢病毒载体,对人肝癌细胞SMMC-7721 MCM7基因表达和裸鼠移植瘤生长的影响。方法构建重组逆转录慢病毒载体MCM7-shRNA,以MCM7基因沉默重组慢病毒颗粒(LV-shRNA-MCM7)感染SMMC-7721细胞,作为实验组;以对照慢病毒颗粒(LV-shRNA-NC)感染SMMC-7721细胞,作为阴性对照组;空白对照组常规培养,不做任何处理。通过嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞株。3组细胞分别接种至裸鼠皮下,建立人肝癌裸鼠移植瘤模型。观察裸鼠成瘤情况、移植瘤生长情况并绘制肿瘤生长曲线;4周后测定肿瘤体积和质量,并用RT-PCR、实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法及免疫组织化学法检测移植瘤中MCM7的表达情况。结果 MCM7-shRNA慢病毒载体构建成功。裸鼠接种癌细胞后第6天均有肿瘤形成,与空白对照组和阴性对照组相比,实验组的肿瘤生长速度明显减慢,实验组、阴性对照组和空白对照组的瘤体平均体积分别为(27.72±7.80)、(81.86±10.91)和(79.75±16.61)mm3,差异有统计学意义,F=61.949,P<0.05;实验组、阴性对照组和空白对照组的瘤体平均质量分别为(0.19±0.06)、(0.501±0.14)和(0.509±0.18)g,差异有统计学意义,F=18.41,P<0.05。实验组MCM7mRNA的相对表达量为0.253±0.198,阴性对照组1.213±0.548,空白对照组1.201±0.744,实验组相比阴性对照组和空白对照组明显下降,差异有统计学意义,F=4.091,P<0.05;实验组MCM7蛋白相对表达量为0.207±0.015,阴性对照组1.116±0.062,空白对照组1.088±0.040,实验组相比阴性对照组和空白对照组明显下降,差异有统计学意义,F=292.778,P<0.05。MCM7蛋白在阴性对照组和空白对照组中阳性表达率均为100%(10/10),在实验组中为30%(3/10),实验组明显低于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义,χ2=18.261,P<0.001。结论慢病毒沉默SMMC-7721细胞MCM7基因表达能有效抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生长,MCM7基因可能成为肝癌基因治疗的有效靶点。     

跨种属研究Smad3在肝癌组织中的表达及意义

 目的：研究Smad3在人、大鼠、树鼩等不同种属的肝癌、癌旁及正常肝组织中的表达和意义,进一步验证跨种属筛选肝癌关键蛋白研究策略的可行性。方法：采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术分别检测人、大鼠和树鼩的肝癌及其相应癌旁组织以及正常肝组织中Smad3 mRNA和蛋白表达水平。结果：Smad3 mRNA在人、大鼠和树鼩的肝癌中表达水平均低于其相应的癌旁组织（均P<0.05）;在大鼠肝癌组织中的表达低于正常肝组织（P<0.05）;在树鼩癌旁组织中的表达高于正常肝组织（P<0.05）;其余各组织间mRNA表达水平的差别无统计学意义（均P>0.05）。Smad3蛋白在人和大鼠的肝癌组织中的表达水平均低于其相应的癌旁组织及正常肝组织（均P<0.05）;在树鼩肝癌组织中的表达水平也低于相应的癌旁组织和正常肝组织,但差别无统计学意义（均P>0.05）;3个种属的癌旁组织与正常肝组织比较,差别无统计学意义（均P>0.05）。结论：Smad3在人、大鼠和树鼩3个种属的肝癌组织中的mRNA和蛋白表达水平均下调,提示该蛋白表达水平的改变可能在肝癌发生发展中起重要作用,有可能成为防治肝癌的靶分子。     

Cdc25a在跨种属肝癌组织中的表达及其意义*

 目的：研究细胞周期通路中的细胞分裂周期蛋白25a (Cdc25a)在人、大鼠和树鼩不同种属的肝癌、癌旁及正常肝组织中的表达和意义,进一步验证跨种属筛选肝癌关键基因研究策略的可行性。方法：采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测人、大鼠和树鼩的肝癌及其相应癌旁组织以及正常肝组织中Cdc25a mRNA和蛋白表达水平。结果：Cdc25a mRNA表达水平在人、大鼠和树鼩的肝癌组织中均高于正常肝组织（均P<0.05）;在人和大鼠肝癌组织中的表达高于其对应的癌旁组织（P<0.05）;其余各组织间mRNA表达水平的差别无统计学意义（均P>0.05）。Cdc25a mRNA在人肝癌组织中的表达水平与病人的临床分期、门脉癌栓及肝外转移明显相关,而与术后复发、肿瘤直径、肿瘤个数、血清甲胎蛋白水平和肿瘤分化无明显关系。Western blotting检测结果显示Cdc25a在人、大鼠和树鼩肝癌组织中的蛋白表达水平均较癌旁和正常肝组织显著上调。结论：Cdc25a有可能是影响肝癌发生和发展的重要分子之一,跨种属筛选肿瘤关键基因策略可能有助于发现肝癌关键基因。     

基因富集及Meta分析对影响肝癌发生发展关键基因的筛选

目的:筛选影响肝癌发生发展的关键基因.方法:运用跨种属肿瘤基因筛选策略比较不同种属的肝癌基因表达谱间的相似改变,选择5套不同种属的肝癌基因表达芯片分别通过基因组富集(gene set enrichment analysis,GSEA)以及对单套数据集单个基因元分析(meta-analysis,Meta)的分析方法,筛选出在转录水平上影响肝癌的基因.结果:用GSEA方法分析,5组数据中所得通路对比,上调中皆有的通路为氨基糖核苷酸糖代谢、细胞周期、甲状腺癌;下调中皆有的通路为亚油酸代谢、花生四烯酸代谢.对单套数据集单个基因进行Meta分析,共筛出P<0.05的基因1708个.用DAVID和KEGG网站的分析工具发现这1708个差异基因中有720个基因能够在KEGG库中筛出,主要分布在细胞周期、卵母细胞减数分裂、DNA复制等通路.这两种分析方法得出的通路中,重叠性较高的主要为细胞周期通路.在细胞周期通路中差异性有统计学意义(P<0.05)的基因25个,文献报道其中5个基因与肝癌有密切联系.结论:可能影响肝癌发生发展的信号传导通路是细胞周期通路,后续我们将对细胞周期通路里的显著性基因进行验证.     

树鼩乳汁的主要成分检测及其意义

目的探讨树鼩乳汁的基本成份,并和其它乳制品成份进行了比较分析。方法选取10只分娩后(1~21)d期间的哺乳期母树鼩,用人工被动母乳喂养方法让仔树鼩自由吮吸母乳,立即采用无菌操作的方法用注射器直接采取仔树鼩胃内的乳汁,1次/2 d,连续3~5次,每只母树鼩采取18 mL乳汁,按照国家标准的方法进行成分检测。结果树鼩乳汁总固形物为43.63%、脂肪为26.01%、蛋白质为10.41%、乳糖为0.45%、灰分为0.99%。树鼩乳的总固形物、灰分、蛋白质、脂肪、乳糖含量分别为牛乳的3.36、1.24、2.74、6.67、0.09倍;树鼩乳的总固形物、灰分、蛋白质、脂肪、乳糖含量分别为婴幼儿配方乳的1.44、0.20、0.58、1.53、0.06倍;与牛乳及婴幼儿配方乳矿物质成分含量相比,树鼩乳的矿物质成分钙、磷、钾、钠、镁、铁、锌含量均大于牛乳,分别为1.83、2.73、1.25、1.93、1.28、1.48倍,而均小于婴幼儿配方乳,分别为0.66、0.85、0.34、0.26、0.85、0.24、0.49倍。结论树鼩乳的主要营养成分呈现高脂高蛋白低糖的类型,可为树鼩人工育幼和饲养工作提供依据。     

L-NAME调控EMT抑制卵巢癌细胞迁移

目的探讨一氧化氮合酶泛抑制剂左旋硝基精氨酸甲基酯(L-NAME)对卵巢癌SKOV3细胞体外增殖、迁移以及对上皮间充质转化(EMT)标志物的影响。方法利用L-NAME抑制卵巢癌SKOV3中一氧化氮合酶(NOS)功能,以L-NAME处理组为实验组,二甲基亚砜(DMSO)组为对照组,采用CCK8增殖实验、平板克隆形成试验、划痕试验和Transwell小室迁移实验检测L-NAME对卵巢癌SKOV3细胞增殖和迁移功能的影响;并利用荧光定量PCR和Western blot检测卵巢癌细胞上皮细胞标志物E-cadherin和间充质细胞标志物N-cadherin、Vimentin和Fibronectin的表达,观察L-NAME对卵巢癌SKOV3细胞EMT标志物的调控作用。结果 CCK8增殖实验和平板克隆形成实验显示L-NAME抑制SKOV3细胞增殖功能(P0.05);划痕实验和Transwell小室实验显示L-NAME抑制SKOV3细胞迁移功能(P0.05);荧光定量PCR和Western blot结果显示L-NAME上调E-cadherin的表达,下调N-cadherin、Vimentin和Fibronectin的表达(P0.05)。结论 L-NAME抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移功能,调节EMT标志物变化。     

一氧化氮合酶在结肠癌中的表达及其相关功能的初步分析

目的：分析3种一氧化氮合酶（ NOS）亚型在结肠癌中的表达差异,探讨神经元型一氧化氮合酶（ nNOS）对结肠癌细胞增殖和迁移功能的影响。方法利用流式细胞术、Western blot、免疫荧光、组化等技术,对6株结肠癌细胞（SW480,SW620,RKO,LOVO,HT29,M5）和10例组织样本中NOS的表达进行分析。而后分别以NOS抑制剂干预NOS的功能活性,分析NOS对结肠癌细胞功能的影响。结果3种NOS在结肠癌细胞和结肠癌组织中均有表达,以胞浆表达为主,部分核表达。流式细胞术和Western blot 定量显示nNOS在所有样本中表达最强（分别为239±4.7～693.3±38.0和0.263±0.05～0.696±0.098）,诱导型一氧化氮合酶（iNOS）居中（分别为42.7±13.6～236±34.0和0.079±0.04～0.291±0.006）,内皮型一氧化氮合酶（eNOS）微弱或不表达（分别为13±7.4～68±13.6和0.019±0.004～0.123±0.004）。增殖和迁移功能实验显示,同时抑制3种NOS亚型或选择性抑制nNOS,可显著下调结肠癌细胞株的增殖和迁移功能（与对照组比较,抑制增殖迁移能力中位百分数为42.5％,P＜0.05）,而选择性抑制iNOS效果微弱（仅抑制9.7％中位百分数的增殖迁移能力,P＞0.05）。结论nNOS对结肠癌增殖和迁移起着重要作用,针对nNOS表达干预治疗可能成为将来结肠癌临床治疗的手段之一。     

MCM7蛋白在人大鼠树鼩肝癌组织中的表达和意义

  目的  应用跨种属策略研究MCM7蛋白在人、大鼠、树鼩3个不同种属肝癌、癌旁组织及正常肝组织中的表达,探讨MCM7与肝癌发生发展的关系及临床意义。  方法  应用Western blot及免疫组织化学技术检测MCM7蛋白在人、大鼠、树鼩的肝癌、癌旁组织及正常肝组织中的表达并进行临床病理因素分析。  结果  Western blot结果显示,MCM7蛋白在人和大鼠肝癌组织中的表达水平显著高于对应癌旁及正常肝组织（P均 < 0.05）,在树鼩肝癌组织中MCM7蛋白的表达水平亦高于其癌旁组织及正常肝组织,但差异无统计学意义（P均>0.05）。免疫组织化学结果显示,MCM7蛋白主要在细胞核中表达,其在人、大鼠、树鼩肝癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁及正常肝组织（P均 < 0.05）;MCM7蛋白的表达水平与患者肝癌分期、肝外转移及术后复发相关（P均 < 0.05）。而3种属的癌旁组织与正常肝组织相比,两种技术检测结果显示差异均无统计学意义（P均>0.05）。  结论  MCM7蛋白在肝癌发生发展中可能起着关键分子的作用,并与人肝癌的临床分期,肝外转移及术后复发密切相关,有可能成为肝癌治疗的新靶点。