H5N1禽流感病毒感染孕鼠的研究

目的用H5N1禽流感病毒感染昆明孕鼠,检测病毒在感染孕鼠各组织脏器中的复制及分布情况,并证明病毒能否通过孕鼠的胎盘垂直传染给胎鼠。方法用虎源H5N1亚型禽流感病毒滴鼻感染妊娠10-12 d的昆明孕鼠,观察孕鼠感染后的临床症状。接种病毒后第3、4、5、6和7 d分别处死3只孕鼠,取孕鼠的肺、脑、脾、肾、子宫、胎盘及胎鼠,利用RT-PCR、Real-time PCR和病毒分离方法检测各组织中的病毒核酸和病毒滴度,并进行病理组织学与免疫组织化学检测。结果昆明孕鼠接种病毒后第3 d,即可在肺、脑、脾、肾、子宫及胎盘组织中检测出H5N1禽流感病毒核酸,并从子宫、胎盘分离出H5N1禽流感病毒;感染后第6 d,从胎鼠体内检测到病毒核酸并分离出H5N1禽流感病毒。结论H5N1亚型禽流感病毒可以感染孕鼠,在孕鼠子宫和胎盘复制,感染后期可通过胎盘屏障传给胎鼠。     

SARS冠状病毒灭活疫苗研究初报

目的研制出安全、有效、质量可控的SARS冠状病毒灭活疫苗;同时,制备能用于SARS被动免疫和治疗用的异源高效价特异性抗体,用于SARS的免疫防治.方法采用细胞培养法,从非典型肺炎患者标本中分离获得病毒株,通过电镜、血清学以及RT-PCR技术进行病毒鉴定.运用细胞规模化培养技术大量制备SARS冠状病毒.用温度灭活法和甲醛灭活法对SARS冠状病毒进行灭活处理,筛选灭活条件.将不同类型和不同剂量的佐剂与灭活病毒加以配伍,优化SARS灭活疫苗;同时,以小鼠、兔、猴等为实验对象,进行灭活疫苗的免疫原性评价.用灭活疫苗免疫马,获取异源(马)高免血清,并进行应用效果评价.结果从分离得到的SARS冠状病毒中,优选出适合疫苗制作的SARS病毒株2株-F69和Y3,初步建立了大规模培养SARS病毒的技术体系,病毒TCID50达到106以上.确定了SARS病毒的灭活方法,优选出灭活疫苗的佐剂,并已生产出一定量的SARS灭活疫苗.将灭活疫苗初步用于小鼠、兔等的免疫接种,对其体液免疫和细胞免疫效果进行了初步检测.结论试验研制的SARS灭活疫苗具有较强的免疫原性,设计的灭活疫苗生产技术路线是可行的,进一步的研究工作结束后,可望进行规模化开发生产.     

裂谷热病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的RealtimePCR（实时荧光定量PCR）方法,用于裂谷热病毒（RVFV）的检测。方法根据裂符热病毒N蛋白基因的保守序列设计并合成一对引物及特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释重组质粒为标准品,进行Real-timePCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、准确性、特异性及敏感性检测。结果建立的Real-timePCR方法检测裂谷热病毒所绘制标准曲线的相关系数大于0．99,灵敏度为1．0×10^1拷贝,高于常规PCR方法（1．0×10^3拷贝）;除裂谷热病毒外的其他7种对照烈性病病原体基因检测均呈阴性;批内重复和批问重复的变异系数均小于1％。结论建立的裂谷热病毒Real-timePCR检测方法敏感性和特异性较高,可用于裂谷执病毒感染懊涑诊眯斤殛流行病学谰杏．     

弓形虫HT分离株ROP5蛋白基因的克隆、序列分析及其表达研究

目的克隆和表达弓形虫虎源分离株（HT株）ROP5蛋白基因。方法运用RT—PCR技术从弓形虫HT株中扩增出ROP5基因，将其克隆人T载体中进行测序和分析．并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。结果该基因全长1650bp，编码549个氨基酸。其中前24个氨基酸构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比，有12个核苷酸有差异，导致7个氨基酸发生改变，两者核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99．2％和98．9％。转化重组质粒pETROP5的大肠杆菌BL21（DE3）在IPTG的诱导下，可表达出相对分子质量为64800的重组蛋白，并且能与弓形虫抗体发生血清学反应，表达量占菌体蛋白的15．6％。结论成功克隆和表达了弓形虫HT株ROP5蛋白基因，表达的重组蛋白具有良好的反应原性。     

金刚烷胺修饰物抗禽流感病毒的作用机制

目的：初步探讨金刚烷胺修饰物（NAM）抗禽流感病毒的作用机制,为抗禽流感病毒新药NAM的开发提供实验依据。方法：对狗肾细胞（MDCK）进行体外培养,分为正常对照组,病毒对照组和受试物组。①采用细胞病变法结合MTT法检测NAM对禽流感病毒（H5N1）的抑制作用,受试物组分为先加入NAM后感染病毒、先感染病毒后加入NAM和感染病毒的同时加入NAM,观察3种方式NAM对禽流感病毒的半数抑制浓度(IC50)和治疗指数(TI);②采用神经氨酸酶抑制实验检测NAM对神经氨酸酶的活性影响。结果：① 3种不同的实验方式NAM剂量对数与细胞保护率均呈正相关关系（r 分别为0.95、0.95和0.99,P均<0.05）,且NAM与保护率存在量效依赖关系。先加入NAM后感染病毒,NAM的IC50为15.32 mg·L-1,TI为103.31;先感染病毒后加入NAM,NAM的IC50为30.78 mg·L-1,TI为28.10;感染病毒的同时加入NAM,NAM的IC50为203.92 mg·L^-1,TI为4.24。②NAM具有一定的流感病毒神经氨酸酶抑制活性,其IC50为87.36 mg·L^-1。结论：NAM对穿入细胞后的禽流感病毒有较好的抑制作用,同时干扰病毒吸附和侵入细胞的脱壳过程也有一定的作用,能够在一定程度上抑制病毒的神经氨酸酶活性。     

小反刍兽疫病毒H基因的真核表达

目的构建小反刍兽疫病毒（PPRV）H基因真核表达载体,并对其表达能力及免疫活性进行鉴定,为后期疫苗的研制提供基础。方法根据GenBank上公布的PPRV（China/Tib/Gej/07-30株）H基因的序列进行引物设计并进行扩增,纯化回收后将其克隆到pMD-18T载体中,将测序鉴定正确的目的基因克隆到真核表达载体pCAGGS上。结果成功构建了含有PPRV H基因的真核表达载体pCAGGS-H。通过脂质体介导质粒pCAGGS-H转染DK细胞,经间接免疫荧光及Western blot证实,表达蛋白分子质量单位为68.8 ku,能与PPRV阳性血清发生特异性反应。结论 pCAGGS-H在真核细胞内可有效表达。     

荧光定量RT—PCR方法检测感染小鼠不同组织中的HSN1禽流感病毒

目的测定H5N1禽流感病毒感染小鼠各脏器组织中的病毒核酸含量，了解病毒复制与疾病进程的关系，为H5N1禽流感病毒致病机理与防治研究提供技术支持。方法利用建立的荧光定量RT-PCR法对H5N1禽流感病毒感染BALB／c小鼠的不同脏器组织中病毒核酸进行定量检测，观察H5N1禽流感病毒在不同组织中的复制情况。结果利用荧光定量RT-PCR法可从H5N1禽流感病毒感染小鼠后第3d的肺脏、脑、脾脏、肾脏和肝脏组织中检测到不同含量的病毒核酸；而在感染后4d的肺脏、脑和脾脏等组织中的病毒核酸含量开始下降；在感染后第6d，H5N1禽流感病毒核酸在肺脏和脑组织中大量存在外．其余组织中均有少量病毒核酸。结论H5N1流感病毒感染小鼠肺脏和脑组织中病毒核酸含量较高，说明病毒主要在小鼠的肺脏和脑组织中复制。由于荧光定量RT-PCR法可对感染小鼠不同脏器组织中的病毒核酸进行准确定量，可为H5N1禽流感病毒所致疾病的早期诊断、流行病学和致病机理研究提供技术支持。     

NP基因特异性干扰RNA抑制H5N1高致病性禽流感病毒复制的研究

目的设计针对H5N1高致病性禽流感病毒（HPAIV）核蛋白（NP）基因的干扰RNA（siRNA）,研究其在细胞水平抑制病毒复制的效果。方法根据siRNA设计原则,设计并合成3对靶向HPAIV NP基因的siRNA,构建表达性质粒（ps-NP732、ps-NP863、ps-NP1344）,分别转染MDCK细胞并攻毒,通过病毒滴度测定r、eal-time PCR、间接免疫荧光试验和Western blot,检测siRNA抑制AIV复制的效果。结果设计的3对siRNA中,ps-NP863明显抑制AIV复制,病毒滴度与对照组相比降低31倍,real-time PCR、间接免疫荧光试验、Western blot结果与病毒滴度测定结果相符,而ps-NP732和ps-NP1344无抑制AIV复制作用。结论构建的ps-NP863可显著抑制HPAIV复制,为开发抗AIV治疗制剂和动物机体抗AIV研究奠定了基础。