FGF2 人源化单抗E12 及其联合顺铂/ 紫杉醇体外抑制乳腺癌细胞增殖作用的研究

目的:研究人源化FGF2 单抗体E12 体外联合化疗药物抑制乳腺癌肿瘤细胞增殖的作用。方法:分析人源化FGF2 单抗可变区人源氨基酸序列比率;SDS-PAGE 和HPLC 检测单抗纯度;ELISA 测定单抗效价;BSA 法检测单抗浓度;CCK-8 法检测单抗联合化疗药物对乳腺癌肿瘤细胞株的细胞增殖抑制作用;流式细胞术检测FGF2 单抗联合化疗药物对乳腺癌细胞株的促凋亡作用;使用Discovery Studio 4.5 软件对单抗的表位进行分析。结果:单抗可变区人源氨基酸序列比率重链为98.89%,轻链为100.00%;单抗纯度为99.02%;单抗ELISA 效价为1/243 000;单抗浓度为8.74 mg/ ml;CCK-8 结果表明顺铂为10、5、2.5、0.625 μg/ ml 时,单抗+顺铂组比顺铂组对MCF-7 细胞抑制率提高了14.5%、10.4%、1.5%、0.5%;对MDA-MB453 细胞抑制率提高了15.5%、14.8%、13.0%、6.8%,紫杉醇为1.0、0.1、0.01 μg/ ml 时,单抗+紫杉醇组比紫杉醇组对MCF-7 细胞抑制率提高了14.5%、11.1%、9.3%,紫杉醇为0.1、0.01、0.001 μg/ ml 时,单抗+紫杉醇组比紫杉醇组对MDA-MB453 细胞的抑制率提高了18.6%、19.9%、6.8%;流式结果表明,单抗、紫杉醇及单抗+紫杉醇组的MCF-7 细胞在AnnexinV/ PI 双阳性区所占比例提高了6.13%、7.36%和12.83%,同理MDA-MB453 细胞所占比例提高了4.86%、7.1%和14.1%,单抗、顺铂及单抗+顺铂组MCF-7 细胞在Annexin V/ PI 双阳性区所占比例提高了6.39%、9.46% 和17.76%,同理MDA-MB453细胞所占比例提高了5.38%、9.06%和19.39%;表位分析结果表明FGF2 单抗有效封闭FGF2 与受体结合的部分位点。结论:FGF2 人源单抗E12 人源化程度较高;FGF2 人源化单抗联合化疗药物相对单药组可较明显地提高肿瘤细胞增殖抑制作用以及促细胞凋亡作用;本研究为FGF2 抗体药物研发提供了前期基础。     

人心肌肌钙蛋白玉鲁米诺化学发光酶免疫分析法的建立

目的:制备两株抗人心肌肌钙蛋白玉(human cardiac troponin Ⅰ,cTnⅠ)单克隆抗体,建立鲁米诺化学发光酶免疫分析法。方法:制备腹水型单抗、饱和硫酸铵沉淀法和亲和层析柱Protein G 纯化抗体,并通过SDS-PAGE 和ELISA 对抗体特异性进行鉴定,建立鲁米诺化学发光酶免疫分析法,并对30 份临床血清样本进行检测。结果:本实验制备的两株单抗(分别命名为Ab1、Ab3;亚型都是IgG1)能够识别以cTnⅠ单体、cTnⅠ-C 复合物和cTnⅠ-T-C 复合物不同形式存在的cTnⅠ。Ab1、Ab3 的效价分别为1 :80 万和1 :40 万,亲和力常数分别为1.62×10⁹L/ mol、2.60×10⁸ L/ mol。利用2 株单抗建立的鲁米诺化学发光酶免疫分析法检测范围为:6.25 ~ 400 ng/ ml。对30 份临床样本进行检测,阳性检出率为77.3%,阴性检出率为100%。结论:建立了可以检测以cTn玉单体、cTnⅠ-C 和cTnⅠ-T-C 复合物形式存在的cTnⅠ的鲁米诺化学发光酶免疫分析法,具有更高的实用性。     

抗碱性成纤维细胞生长因子对家兔实验性矽肺发生发展的影响

采用抗碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）血清进行家兔实验性矽肺的治疗。结果发现：９０天的实验组矽结节比对照组明显减少减小，对照组矽结节以成纤维细胞为主夹杂少量胶原纤维，而实验组仍停留在以巨噬细胞为主的细胞性矽结节阶段；至１８０天，对照组矽结节主要由胶原纤维组成，而实验组矽结节则仍以巨噬细胞为主；体外小鼠胚胎肺成纤维细胞培养，结果显示ｂＦＧＦ明显促进细胞生长，而抗ｂＦＧＦ血清则抑制其生长，与上述体内实验结果相一致。表明抗ｂＦＧＦ能阻抑纤维化的进展。     

碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体在小鼠体内药代动力学研究

目的研究碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体(basic fibroblast growth factor monoclonal antibody,bFGF-mAb)在小鼠体内的药代动力学特征。方法首先制备bF-GF-mAb并纯化,然后用氯胺T法制备125I-bFGF-mAb,γ放射免疫计数仪检测三氯醋酸(TCA)沉淀前后血浆、组织的放射性计数,用3P97软件拟合药代动力学房室模型,并计算相应药代动力学参数。结果氯胺T法制备的125I-bFGF-mAb,其放化纯度≥98%,TCA沉淀率(90.8±10.2)%。T12α为0.1～0.2 h,T12β为1.05～1.84 h和T 12γ为81.6～90.3 h。125 I-bFGF-mAb在小鼠的心、肝、肺等组织器官中有较高的放射性计数,在脑和眼中放射性计数较低。结论 125I-bFGF-mAb的药代动力学符合三室模型,且具有组织分布特异性。     

VEGF189基因合成、原核表达及鉴定

目的 获得编码VEGF189蛋白的基因,并通过原核表达系统表达VEGF189融合蛋白.方法 应用SOE PCR技术合成VEGF189基因,克隆入pET-32a(+)原核表达载体,转化E coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blot检测,表达产物经HisTrapTM HP亲和柱层析纯化,测定蛋白浓度.结果 DNA测序分析表明,合成的VEGF189基因与文献报道相一致.在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的Trx-VEGF189融合蛋白,以包涵体和可溶2种形式存在.表达产物可被兔抗鼠VEGF多抗特异识别.经HisTrapTM HP亲和柱纯化,获得纯度达85%的融合蛋白.结论 成功合成VEGF189基因,并在原核表达系统中获得高表达,为研制高效抗肿瘤的VEGF抗体和疫苗奠定了前期基础.     

抗重组人bFGF单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的：从分泌抗重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）单克隆抗体（mAb）杂交瘤细胞株B2F3中克隆抗体可变区（V）基因，构建bFGF单链抗体（scFv），并进行可溶性表达。方法：从分泌bFGF mAb杂交瘤细胞株B2F3提取总RNA，用RT-PCR方法扩增抗体重链可变区基因（VH）和轻链的可变区基因（VL）；再通过重叠延伸拼接（SOE）PCR方法，在VH和VL基因之间引入linker（Gly4Ser）3，构建bFGF scFv。将测序正确的scFv基因克隆到表达载体pCANTAB 5E中，选择非抑制型菌株E.coli HB2151进行可溶性表达；经SDS—PAGE检测抗体表达水平，ELISA鉴定其抗原结合活性。结果：测序分析结果显示，VH基因序列全长375碱基对，编码125个氨基酸，VL基因序列全长399碱基对，编码133个氨基酸，二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征，含有4个框架区（FR）、3个抗原互补决定区（CDR）及抗体特征性的2个半胱氨酸残基；构建的scFv全长789碱基对，编码263个氨基酸，连接结构为VH-linker-VL。SDS-PAGE分析表明scFv基因在大肠杆菌为可溶性表达，表达产物主要位于周质腔中，表达产物的Mr为27000，与理论预期值相符；间接ELISA检测结果显示原核表达的scFv具有与bFGF特异性结合的活性。结论：成功地克隆bFGF mAb可变区基因，并构建表达bFGF scFv，为下一步研究bFGF抗体人源化改造奠定实验基础。     

bFGF单抗协同替吉奥抑制肺癌Lewis细胞的增殖及移植瘤血管新生

目的:探讨碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)单抗与替吉奥(gimeracil and oteracil porassi-um,又称S-1)联合应用体内外抑制小鼠Lewis肺癌细胞增殖、移植瘤生长及转移、肿瘤血管新生的协同作用。方法:CCK-8法检测bFGF单抗及S-1对Lewis细胞增殖的抑制作用。建立C57BL/6小鼠Lewis肺癌自发转移瘤模型,32只小鼠随机分成生理盐水(NS)组、bFGF单抗组、S-1组和bFGF单抗+S-1组,每组8只;测量瘤体,绘制生长曲线,称瘤质量并计算抑瘤率;计数各组肺表面转移瘤结节;CD31标记血管内皮细胞,计数转移瘤微血管密度(microvessel density,MVD)。结果:bFGF单抗、S-1剂量依赖性抑制Lewis细胞增殖(P<0.05),联合用药组抑制率明显高于单药组(P<0.05或P<0.01)。bFGF单抗组、S-1组以及bFGF单抗+S-1组对Lewis转移瘤的抑瘤率分别为37.8%、47.7%、65.9%,联合组抑瘤率明显高于单药组(P<0.05或P<0.01)。联合组肺表面转移结节、微血管密度明显低于单药组(2.71±0.76vs6.57±0.98、4.71±0.76;21.6±2.9vs33.4±4.9、41.9±6.3;P<0.05或P<0.01)。结论:bFGF单抗联合S-1对Lewis肺癌移植瘤具有协同抑制作用,其机制与抑制细胞增殖及血管新生有关。     

食物过敏中肥大细胞释放组胺的研究进展

组胺是Ⅰ型变态反应中最重要的炎性介质,深入研究肥大细胞的组胺释放,对食物过敏的防治具有重要的意义。本文介绍食物过敏中肥大细胞组胺释放机制、组胺检测方法及检测组胺的意义等方面的研究进展。     

人工合成VEGF表位模拟7肽的生物学功能研究

目的: 检测人工合成血管内皮细胞生长因子(VEGF)表位模拟 7肽特异抑制VEGF促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生长的活性。方法: 通过噬菌体展示技术, 筛选获得了表达模拟肽的阳性噬菌体克隆, 经测序得到VEGF表位模拟肽序列: GWYYDAX。人工合成该短肽, 用体外细胞培养的方法检测其对HUVEC的生长抑制作用。结果: 表位模拟肽GWYYDAX可剂量依赖性抑制VEGF促进HUVEC生长的活性。结论: VEGF表位模拟肽可能模拟了VEGF的部分结构, 竞争结合HUVEC细胞VEGF受体 (KDR), 阻断了VEGF VEGFR的信号传递而抑制细胞生长, 具有潜在的应用前景。     

碱性成纤维生长因子单克隆抗体联合伊立替康抑制小细胞肺癌H223细胞的增殖

目的 探讨碱性成纤维生长因子(bFGF)单克隆抗体与伊立替康联合应用体外对抑制小细胞肺癌细胞株增殖和凋亡的作用及可能机制.方法 CCK8检测bFGF单克隆抗体联合伊立替康对小细胞肺癌株H223增殖的抑制作用.AnneginV-FITC/PI染色流式细胞仪检测新型bFGF单克隆抗体联合伊立替康对小细胞肺癌株H223凋亡的影响.Western blotting分析bFGF-mAb联合CPT-11对AKT和ERK1/2磷酸化水平的影响.结果 bFGF单克隆抗体、伊立替康剂量依赖性抑制小细胞肺癌株H223的增殖,bFGF单克隆抗体组、伊立替康组及bFGF单克隆抗体联合伊立替康组对小细胞肺癌株H223的增殖抑制率分别为18.73%、21.96%、54.30%,联合用药组抑制率明显高于单药组(P<0.05).bFGF单克隆抗体、伊立替康剂量依赖性诱导小细胞肺癌株H223的凋亡,bFGF单克隆抗体组、伊立替康组及bFGF单克隆抗体联合伊立替康组诱导小细胞肺癌株H223的早期凋亡率分别为2.7%、4.3%、6.5%,联合用药组凋亡率明显高于单药组(P<0.05).bFGF单克隆抗体组、CPT-11组及bFGF单克隆抗体联合CPT-11组可明显抑制p-AKT蛋白和p-ERK1/2蛋白的水平,差异有显著性,而对AKT、ERK1/2蛋白则影响不大.bFGF抗体联合CPT-11一方面通过抑制p-AKT蛋白和p-ERK1/2蛋白的水平来抑制肿瘤细胞的增殖和转移.结论 bFGF单克隆抗体联合伊立替康对小细胞肺癌株H223具有协同抑制作用,其机制与抑制细胞增殖和促进细胞凋亡有关.信号通路分析结果表明bFGF单克隆抗体联合伊立替康能有效阻断与bFGF相关的MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路.