一种快速检测HBV基因的荧光定量PCR法的建立

目的：利用二聚体蝎型荧光探针技术,建立一种能用于临床的快捷、敏感、特异、价格低廉的HBV实时荧光定量PCR检测方法。方法：根据HBV基因组保守区域precore／core设计二聚体蝎型荧光探针和引物,构建质粒标准品,优化荧光定量PCR条件,并进行方法学评价。结果：所建方法的检测范围为10^1～10^8 copies／μl,灵敏度达到10copies／μl,低拷贝样品的批内和日间重复性（CV）分别为1．71％和2．57％,高拷贝样品的批内和日间GV,分别为3．00％和3．86％。与商品化TaqMan试剂盒相比,本法阳性检出率较高,且检测时间缩短了45min（约减少1／3）,成本降低50％。结论：成功建立了快速检测HBVDNA的二聚体蝎型荧光定量PCR方法,为研发适合临床应用的HBV基因定量检测试剂盒奠定了基础。     

自身猝灭探针定量PCR检测HCV方法的建立

目的 建立自身猝灭荧光探针定量PCR技术检测HCV方法.方法 构建重组质粒pMD18-T-HCV5'NCR作为标准品,并通过Sigma在线软件设计自身猝灭探针,优化定量PCR体系,并进行方法学评价.结果 建立了自身猝灭荧光探针的定量PCR方法,线性为101～1010copies/μl;灵敏度达50 copies/μl;批内CV为6.1%,批间CV为6.5%,日间CV为6.8%;特异性为100%,与其他肝炎病毒无交叉反应.与紫外定量方法比较,结果差异无显著性,且高度相关.结论 以自身猝灭荧光探针建立的HCV荧光定量PCR检测方法,灵敏度高、特异性强,为新型试剂盒的开发奠定了基础.     

乙型肝炎病毒准种的研究及意义

随着乙型肝炎病毒研究的深入，HBV准种在乙型肝炎患者中普遍存在的概念已得到确认，对于HBV准种与HBV感染的慢性化、药物治疗耐受的关系，以及如何控制HBV准种的发生及演变的研究正在广泛展开。现就HBV基因准种的研究现状及意义进行综述。     

HBV cccDNA荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:评估一个新设计的HBV cccDNA荧光定量PCR检测方法.方法:以肝穿组织为检测标本,采用LightcycleTM探针,通过一对特殊引物,使HBVcccDNA可以扩增而病毒基因组不能扩增;同时利用一种依赖于ATP的特异性DNase提高反应的特异性,以此实现对cccDNA的检测.结果:成功建立了HBV cccDNA荧光定量PCR的检测方法,线性范围为2.5×101～2.69×109拷贝/ml.对5个病例的肝穿样本进行分析,其中3例为乙肝感染患者,并均接受抗病毒治疗达1年,另2例为乙肝阴性患者.检测结果如下:1)2例乙肝阴性患者的肝组织检测结果cccDNA及tDNA皆为阴性.2)接受拉米夫定治疗1年的病人tDNA为7.10×103拷贝/ml,cccDNA为2.64×103拷贝/ml;接受恩替卡韦治疗1年的病人tDNA为1.00×105拷贝/ml,cc-cDNA为4.04×103拷贝/ml;第3例病人接受拉米夫定治疗前tDNA为6.62×103拷贝/ml,cccDNA为3.03×102拷贝/ml,拉米夫定治疗1年后tDNA为5.19 × 103拷贝/ml,cccDNA为1.51×102拷贝/ml.结论:本研究结果显示,所建立的HBVcccDNA荧光定量PCR方法具有良好的线性范围,灵敏度、特异性及准确性均达到预期目标,而且检测所需样本量少,只需约1mg肝穿组织.可作为临床监测抗病毒治疗效果的有效手段和开展HBV复制调控研究的重要工具.     

顺式串联双拷贝DuIFN一γ基因的真核表达

目的:以鸭γ-干扰素(DuIFN-γ)基因为目的基因,研究同一启动子调控下,不同拷贝数的目的基因的表达状况.方法:采用基因重组技术构建含DuIFN-γcDNA单拷贝和双拷贝重组质粒并转入真核细胞COS-7中进行表达.DuIFN-γ活性采用Griess试剂检测.结果:双拷贝重组质粒和单拷贝重组质粒50%最大活性稀释度分别为1:320和1:160.双拷贝重组质粒转染上清稀释10240倍后,仍保留DuIFN-γ活性,而单拷贝重组质粒转染上清经1280倍稀释后,即丧失活性.结论:在同一启动子作用下,顺式插入双拷贝目的基因可明显增强目的基因在真核细胞中的表达量.     

肺炎链球菌绿色荧光蛋白报告质粒的构建及评价

目的：构建一个可高效报告基因表达的绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein,GFP）报告质粒,为采用差异荧光诱导（Differential fluorescence induetion,DFI）技术筛选肺炎链球菌（Streptoccus pneumoniae,S．pn）体内诱导的毒力基因奠定基础。方法：酶切质粒pGreenTIR的SD-ENH-GFP片段,将其插入含氯霉素抗性基因的自杀质粒pEVP3中,构建以绿色荧光蛋白为报告基因的自杀质粒pEVP3-SDGFP。再将肺炎链球菌的溶血素基因（Pneumolysin,ply）上游约500bp片段插入到该质粒报告基因上游的多克隆位点中,得到质粒pEVP3-SDGFP-Ply,将其转化入肺炎链球菌TIGR4中,比较新建质粒pEVP3-SDGFP与同样处理质粒pEGFP-1（报告基因gfp前无SD及ENH序列）报告上游基因表达的情况。结果：通过体内、外实验证实新建质粒pEVP3-SDGFP不但可以报告肺炎链球菌溶血素基因的表达,并且其报告上游基因表达的能力明显强于质粒pEGFP-1。结论：所构建的质粒pEVP3-sDGFP可用于DFI筛选肺炎链球菌体内诱导基因所需启动子诱捕文库的构建。     

重庆市某研究所体检人群中维生素D水平的调查研究

目的 了解重庆地区健康人群维生素D (VitD)营养状况.方法 用串联质谱分析仪检测送检人员血清25-羟维生素D[25(OH)VitD]水平,据此确定VitD营养状况.随机抽取重庆金域医学检验所从2012年1-8月的体检健康人员共3 875例,3～71岁.按年龄分为≤14岁儿童组(657例)、15 ～44岁青壮年组(3 019例)和≥45岁中老年组(199例)3组,采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析.结果 年龄≤14岁组的25 (OH) VitD水平严重缺乏、缺乏、不足、正常、过量所占的比例分别为1.52％、19.03％、9.44％、70.02％和0％;15～44岁组水平缺乏、不足、正常、过量的比例分别为60.09％、27.59％、12.32％和0％;≥45岁组水平缺乏、不足、正常、过量的比例分别为84.92％、13.07％、2.01％和0％.15 ～44岁组和≥45岁组女性25 (OH) VitD平均水平均较男性低,缺乏的女性人数较男性所占比例高,差异均有统计学意义(P＜0.01),而≤14岁组男女间差异无统计学意义;≥45岁组与15 ～44岁组相比,25 (OH) VitD平均水平随着年龄增加而降低,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 重庆地区人群VitD不同程度缺乏,女性缺乏所占比例较男性高,儿童有严重缺乏.     

谷胱甘肽的快速荧光检测法

目的建立一种灵敏、特异、稳定、快速的谷胱甘肽（ＧＳＨ）检测方法。方法用二硫苏糖醇还原,邻苯二醛柱前衍生,用长（１５０ｍｍ ）或短（３０ ｍｍ）反相Ｃ１８柱色谱分离,再用荧光检测器测定血浆ＧＳＨ。结果用 Ｃ１８反相长柱和Ｃ１８反相短柱进行ＧＳＨ色谱分析结果基本一致,两组标准曲线的相关系数为 ０．９９８４。用短柱分析的时间为长柱的 １／７,灵敏度为＜ ２μｇ／Ｌ,在 ２～２００ｍｇ／Ｌ范围内,日内变异系数和日间变异系数均小于 １０％。正常人血浆ＧＳＨ水平为 １１．１６±４．２２ ｍｇ／Ｌ。结论用 Ｃ１８反相短柱进行ＧＳＨ色谱分析,用荧光分光光度计定量是一种灵敏、特异、快速并易于临床开展的检测方法,可用于血浆或器官组织ＧＳＨ水平的研究。     

口服谷胱甘肽在血浆及肝脏分布的实验研究

目的 研究小鼠口服谷胱甘肽后在血浆及肝脏的药物浓度变化。方法 用高效液像色谱仪检测小鼠口服GSH(0．3和3．2mmol／kg)0．125、0．5、1、2、4和8h，血浆及肝脏中的药物浓度。结果 小鼠口服小剂量0．3mmol／kgGSH后，血药浓度变化不大，只有在大剂量3．2mmol／kg时，血药浓度才有明显变化。而肝脏GSH浓度在大、小剂量时均有显著增加。结论 小鼠口服GSH后血浆中的药物浓度不高，但能在肝脏中获得很高的药物浓度。     

HBV前S1抗原与血清标志物的相关性及临床评价

目的分析HBV前S1抗原(Pre-S1Ag)与HBV血清标志物(M)的相关性确定其临床检测的价值。方法收集乙型肝炎患者及乙型肝炎携带者共245例,和45例抗病毒治疗1年治疗前后的留置血清,检测其Pre-S1Ag和HBV-M及HBV -DNA。结果检测分析245份乙型肝炎患者及携带者的Pre -S1Ag和HBV -M及HBV-DNA ,发现HBsAg、HBeAg和抗-HBc均阳性者组Pre-S1Ag与HBV-DNA的检出率分别为95.3%和94.1%,在HBsAg阳性,HBeAg/HBeAb阴性,抗HBc阳性组中,Pre-S1Ag与HBV-DNA检出率分别为83.3%和85.4% ,Pre-S1Ag高检出率伴随HBV-DNA阳性率,HBV-DNA与Pre-S1Ag检出相关性差异无显著性,x2=3.40,P>0.05;HBV-DNA与HBeAg比,x2=88.01,P<0.001,检出率差异有显著性,Pre-S1Ag的检出率及与HBV-DNA的符合率显著高于HBeAg,在HBeAg阴性抗-HBe阳性组中,Pre-S1Ag仍能达到较高的检出率73.8%。45份HBsAg、HBeAg和抗-HBc均阳性者组患者留置血清在用抗病毒药物治疗1年后检测其用药前后Pre -S1Ag和HBV -M及HBV -DNA ,发现HBeAg和HBV-DNA有不同程度的阴转时,Pre-S1Ag并无明显的改变。结论Pre-S1Ag比HBeAg更能敏感地反映乙型肝炎的复制,尤其对HBeAg阴性的患者更具临床价值,对临床观察抗病毒治疗疗效可能有指导意义。