微载体旋转立体培养成人退变髓核细胞增殖及生长动力学研究

[目的]通过单层培养和微载体旋转立体培养成人退变髓核细胞对比,研究两种培养方式对其生长活性及增殖能力的影响.[方法]本实验通过Trypan blue法计数细胞并绘制生长曲线,应用3H- TdR放射免疫法检测退变髓核细胞增殖活性,流式细胞仪检测退变髓核细胞周期,比较两种培养方式对细胞增殖的影响.[结果]微载体旋转立体旋转培养较单层培养细胞从贴壁到对数生长期开始时间( 16～20 d)较长,但是严格意义的稳定生长期(3～5 d)很短;对数生长期长,一般14 ～ 17 d,期间细胞增殖活跃.两种培养方式的细胞处于稳定生长期时,细胞增殖能力没有明显区别,而处于对数生长期时,微载体培养的细胞的增殖能力明显高于单层培养组的细胞(P＜0.05).细胞周期测定显示两种细胞停滞在G0/G1期的占71％左右,培养方式对其影响不明显.而微载体培养的细胞的S期明显较单层培养的细胞为长(P＜0.05).[结论]成人退变髓核应用微载体培养后增殖能力及生长活性提高,可解决组织工程学椎间盘种子细胞难以收集的难题,为将来开展椎间盘组织工程学的研究奠定良好的基础.     

胸椎椎管狭窄症术后急性硬脊膜外血肿

目的探讨胸椎椎管狭窄症术后急性硬脊膜外血肿的成因、诊断、治疗及预防措施。方法回顾性分析2003年6月～2011年12月因胸椎椎管狭窄症给予后路全椎板减压手术的患者101例,其中术后经再次手术证实术区急性硬脊膜外血肿9例,对其临床表现与再次手术情况进行分析。结果 9例患者全部获得随访,随访时间为3～45个月,平均34个月。血肿清除前神经功能评分为0.89±0.78,血肿清除后的神经功能评分为2.33±1.22,与术前相比差异有统计学意义（t=4.91,P〈0.01）。硬膜外血肿压迫时间为（7.72±7.06）min,血肿清除后神经功能恢复率与血肿压迫时间呈负相关（r=-0.789 6,P〈0.01）。结论胸椎椎管狭窄症手术后急性硬膜外血肿应尽快手术减压,血肿清除越早,术后神经功能恢复越好。     

Survivin、TGFβ3和TIMP1基因重组慢病毒多表达载体构建及其表达活性检测

目的应用Gateway技术构建生存素(Survivin)、人转化生长因子β3(TGFβ3)和基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)慢病毒多表达质粒,并检测其表达活性。方法应用Gateway技术,以自剪切多肽2A串联Survivin、TGFβ3、TIMP1的3段外源基因,并克隆到慢病毒多表达质粒上,通过RT-PCR和Western-blot技术分别检测质粒转染293T细胞后目的基因mRNA和蛋白质表达水平。结果 RT-PCR和Western-blot检测结果显示,慢病毒多表达质粒成功表达了3种目的基因,且其mRNA和蛋白质表达水平较空载体对照组、PBS对照组明显升高,差异有显著性(F=17.87~69.11,q=6.94~15.47,P<0.05)。结论成功构建了慢病毒多表达质粒pLenti6.3-Survivin-P2A-TGFβ3-T2A-TIMP1,为下一步病毒的制备以及体内实验提供了基础。     

AAV-hTGF-β1基因体内转染退变椎间盘的实验研究

目的建立一种腰椎间盘退变动物模型,并观察腺相关病毒(AAV)介导人转化生长因子-1β(hTGF-1β)基因体内转染羊退变椎间盘后其退行性的变化。方法16只山羊随机分成A、B、C、D四组(每组4只)。A组仅暴露椎间盘、未损伤,B、C、D三组分别采用不同直径的穿刺针(16 G、18 G、16 G)损伤左前外侧纤维环。3周后,D组椎间盘显微注射AAV-hTGF-1β。分别于术前及术后3、6、12、24周对羊腰椎间盘行放射学和组织学观察。结果A组无明显改变,B、C组有缓慢的椎间盘退行性变化,D组转染后退变发展减缓。结论AAV-hTGF-1β基因体内转染后能阻逆早期椎间盘退变。     

骨质疏松症大鼠骨诱导能力改变的研究

目的　探讨骨质疏松性骨折愈合困难的原因 ,为临床治疗骨质疏松性骨折寻找可行性途径和方法。　方法　雌性SD大鼠 4 0只作为供体大鼠 ,随机分为卵巢切除组和对照组 ,每组 2 0只 ,卵巢切除组切除双侧卵巢以复制骨质疏松模型 ,对照组行假手术。 4个月后处死大鼠 ,取肢体长骨按Urist方法分别制备骨基质明胶。雌性SD大鼠 17只 ,双侧股部切开 ,左、右侧肌袋内分别植入卵巢切除大鼠及对照大鼠骨基质明胶。大鼠饲养 14d处死 ,分别取出肌袋植入物组织行组织学检查及骨碱性磷酸酶 (ALP)活性、Ca含量测定。　结果　卵巢切除组的和对照组的植入物组织ALP活性单位分别为 (7 2 2± 2 5 9)IU/ g和 (12 0 1± 6 18)IU/g ,两者差异有显著性 (P <0 0 1)。卵巢切除组的和对照组的植入物组织Ca含量分别为 (5 10± 0 84 ) μg/ g和 (5 73± 0 79) μg/ g ,两者差异有显著性 (P <0 0 5 )。　结论　雌激素缺失所致骨质疏松骨的骨诱导能力较正常骨明显降低 ,骨质疏松性骨折愈合困难与骨骼中骨诱导生长因子的缺乏有关。对于骨质疏松性骨折的治疗要改进骨折固定方法 ,外源补充或促进内源性骨诱导生长因子的表达 ,对于促进骨折愈合具有重要作用。     

腺相关病毒载体介导结缔组织生长因子对体外转染恒河猴和人腰椎间盘细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原影响的比较

目的比较腺相关病毒载体介导结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）对体外培养的恒河猴和人腰椎间盘细胞转染后蛋白多糖含量和Ⅱ型胶原的影响。方法将恒河猴及成人腰椎间盘髓核细胞进行体外培养,应用rAAV2-CTGF体外转染细胞,分别通过^35S标记蛋白多糖的方法和Ⅱ型胶原的SP-ABC免疫组化法检测腺相关病毒载体介导生长因子对椎间盘细胞蛋白多糖合成和Ⅱ型胶原的影响。结果恒河猴椎间盘细胞能进行体外培养并传代,其形态学特性与培养的成人椎间盘细胞相似,rAAV2-CTGF与对照组相比可促进恒河猴和人椎间盘髓核细胞的蛋白多糖生物合成（P〈0．01）,恒河猴和成人相比生长因子对于蛋白多糖的促进作用无明显差异（P〉0．05）。结论成功培养恒河猴及成人椎间盘细胞,腺相关病毒载体介导CTGF能显著促进髓核细胞蛋白多糖的合成,生长因子对恒河猴和人椎间盘细胞蛋白多糖含量的影响具有很大的相似性。     

经后路寰枢椎椎弓根螺钉侧块固定治疗寰枢不稳或脱位疗效观察

目的 评价后路寰枢椎椎弓根螺钉侧块固定治疗寰枢不稳或脱位的临床疗效.方法 2005年5月至2008年1月,共收治各种原因引起的寰枢椎不稳或脱位患者31例,其中男性23例,女性8例;年龄17～67岁,平均43.5岁.寰枢椎不稳或脱位原因有:齿状突陈旧性骨折17例,游离齿状突8例,齿状突骨折4例,横韧带断裂1例,类风湿关节炎1例.31例患者均有枕颈痛表现,28例有颈椎活动受限,19例有不同程度颈髓受压症状和体征.所有病例均行后路寰枢椎椎弓根螺钉复位固定.记录患者手术时间、失血量和并发症发生情况;同时对手术前后有关临床疗效指标和影像学资料进行对比评价及统计学分析.结果 31例患者平均手术时间2.5 h,平均出血量300 ml.术后均获随访,随访时间6～37个月,平均13个月.1例患者术后出现切口感染,通过调整抗菌素和切口换药2周后得到控制;1例患者术后第5天出现肺动脉栓塞(经肺动脉造影证实),经抗凝等治疗2个月后康复.术中无椎动脉损伤,术后无C_2神经分布区疼痛或麻木病例.31例患者术前存在的枕颈部疼痛均减轻.19例颈脊髓损伤症患者末次随访脊髓功能JOA评分与术前相比明显提高(P<0.01).31例末次随访动态X线片未见寰枢椎移位,无内固定物断裂或松动;CT三维重建有2例患者寰枢椎后弓间骨小梁连续性中断.总融合率达93.6%.结论 后路寰枢椎椎弓根螺钉侧块固定具有直视下置钉、术中复位、良好的三维短节段固定等优势,是良好的寰枢椎后路固定融合技术.     

构建及鉴定人生存素基因的慢病毒表达载体

背景：抑制椎间盘细胞的凋亡可以延缓椎间盘的退变,而生存素具有调节细胞增殖和抗凋亡功能。目的：构建人生存素基因的慢病毒载体。方法：应用全基因合成技术合成人生存素基因（BIRC5）,通过 PCR扩增目的基因并对 PCR 结果进行电泳分析。将目的基因克隆到慢病毒表达质粒构建重组慢病毒质粒 Lenti-BIRC5。将重组的慢病毒质粒转化细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性的克隆进行基因测序。将含有目的基因的慢病毒质粒转染293T细胞,应用Western blot技术对重组慢病毒载体 Flag-Survivin 融合蛋白的表达进行检测。结果与结论：PCR鉴定及基因测序结果显示成功构建了含有人Survivin基因的慢病毒表达载体,Western blot检测结果显示目的基因在体外培养细胞中转染成功并且过表达。说明慢病毒表达载体Lenti-BIRC5构建成功,这为下一步研究Survivin在人髓核细胞中的抗凋亡作用提供了载体。