胚胎小鼠脊髓源性与纹状体源性神经干细胞的培养及分化特点

目的 探讨小鼠脊髓源性神经干细胞与纹状体源性神经干细胞的分离培养方法 及增殖特点,比较两种来源的神经干细胞发育时期上的异同,寻找更有利于脊髓损伤修复的种子细胞.方法 利用显微解剖、无血清培养和单细胞克隆技术在孕14 d小鼠的胎鼠的脊髓及纹状体中分离培养具有单细胞克隆能力的细胞,免疫荧光染色检测克隆细胞的神经巢蛋白(nestin)抗原和诱导分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达,并比较两种来源的干细胞在培养及分化方向上的异同点.结果从胎鼠的脊髓和纹状体中成功分离出神经干细胞.两种来源的干细胞均具有连续克隆能力可传代培养,表达nestin.脊髓血清诱导分化后脊髓源性神经干细胞β-tubulinⅢ阳性细胞(13.5±0.8)较纹状体源性神经干细胞(17.4±1.1)减少,而nestin、GFAP阳性细胞明显增多(45.7±0.3vs 39.2±1.2;25.2±1.3 vs 18.8±0.9),差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 依据细胞增殖特点和分化结果的区别,证实纹状体源性神经干细胞更适合用于移植修复脊髓损伤.     

脑源性神经生长因子基因转染对脊髓神经干细胞分化的影响

目的 研究BDNF基因转染小鼠脊髓源性NSCs向神经元分化情况.方法 选取体外培养E14小鼠胚胎脊髓来源NSCs,构建整合有BDNF基因的逆转录病毒载体,感染体外培养的NSCs,诱导其向神经元分化.采用免疫细胞化学方法鉴定,确定NSCs的分化比例.结果 转染后诱导分化24 h后可见部分细胞贴壁分化,48 h后转染细胞大部分贴壁.BDNF转染NSCs分化为神经元比例较未转染NSCs明显增高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 逆转录病毒载体介导BDNF基因转染NSCs可促进细胞分化,且分化多为神经元方向.

Abstract：

Objective To study the differentiation potential of mouse spinal cord derived neural stem cells (NSCs) into neurons after being transfected with BDNF gene in vitro. Methods Spinal cord derived NSCs from the E14 fetus mouse were isolated and cultured in vitro; the retrovirus containing pLXSN-BDNF gene was established and transfected into thc above NSCs, and thea, spinal cord derived NSCs were induced to be differentiated into neuron-like cells. Immunohistochemistry was employed to detect and calculate the ratio of differentiation of NSCs into neurons. Results The NSCs cultured in vitro partly adhered to the wall and differentiated within 24 h of transfection with BDNF gene, and most of the NSCs adhered to the wall differentiated within 48 h of transfection. The level of neurons from spinal cord derived NSCs modified by BDNF gene was markedly increased as compared with that that from normal spinal cord derived NSCs (P＜0.05). Conclusion NSCs transfected by retroviral pLXSN-BDNF can promote the cell differentiation. BDNF gene can increase greatly the percentage of neurons in the course of inducing the differentiation of mouse NSCs.     

后路全脊椎截骨术治疗先天性脊柱侧后凸畸形

目的评价后路全脊椎截骨术治疗先天性脊柱侧后凸畸形的临床效果。方法 2007年8月至2009年12月,采用后路全脊椎截骨术治疗先天性脊柱侧后凸畸形病例21例,男7例,女14例;年龄7～32岁,平均16.3岁;胸段19例,腰段2例;伴发脊髓纵裂7例,脊髓空洞1例,不全瘫3例。所有病例均行后路一期全脊椎截骨、矫形植骨融合固定术。测量术前、术后及随访时站立位全脊柱正侧位X线片,记录冠状面和矢状面Cobb角、顶椎偏移;记录术中出血量、手术时间及围手术期并发症。结果所有患者切口均一期愈合,随访时间16～38个月,平均22.4个月。本组病例手术时间平均为694.5min,术中出血量平均2429ml,冠状面Cobb角由82.9°矫正到36.0°,平均矫形率56.6%,矢状Cobb角由82.5°矫正到39.8°,平均矫形率51.8%,顶椎偏移由27.1mm矫正到11.1mm,矫正率59.0%。1例术后神经诱发电位示右胫后神经SEP降低,2周后恢复,无其他神经系统并发症,椎体间植骨病例随访时均获得融合,无内固定松动、断裂等并发症。结论后路全脊椎截骨椎体切除可直接去除致畸原因,在冠状面和矢状面上均可获得良好的矫形,并可获360°减压,是目前治疗先天性脊柱侧后凸畸形较为有效的方法。     

脊髓爆震伤后早期治疗神经元的形态学变化

[目的]研究脊髓爆震伤后早期采用不同药物干预对脊髓前角运动神经元影响。[方法]将36只家兔随机分为对照组（A组，n=12）、地塞米松实验纽（B组，n=12）、甲强龙实验组（C组，n=12），每组家兔均采用0．9g单质金属炸药黑索金（cyclotrimethylene trinitramine）进行爆震，伤后各组分别给予静脉输入生理盐水、地塞米松及甲强龙，于伤后6h、24h2个时间点取材，在光镜下观察脊髓前角运动神经元形态和数量的改变。[结果]发现爆震伤后6h脊髓运动神经元出现可逆性改变，伤后24h脊髓死亡运动神经元显著增加，伤后早期给予地塞米松及甲强龙治疗后，死亡神经元的数量减少与对照组相比有显著的统计学意义（P〈0．001），而B、C组之间无显著差别（P〉0．05）。[结论]脊髓爆震伤后早期应用糖皮质激素对运动神经元具有保护作用，在本实验条件下，甲强龙在早期脊髓爆震伤中的疗效与地塞米松相比没有优势。     

Schwann细胞与硫酸肝素-胶原蛋白支架材料的复合

本研究目的是观测硫酸肝素-胶原蛋白支架材料对Schwann细胞的相容性,采用: (1)冷冻干燥法制备硫酸肝素-胶原蛋白支架材料,培养、纯化并鉴定Schwann细胞后,将Hoechst荧光标记的Schwann细胞复合于硫酸肝素-胶原支架材料中,荧光显微镜、扫描电镜及光镜下观察其在材料内部的空间排列形式; (2)以台盼蓝染色、MTT法检测Schwann细胞与硫酸肝素-胶原蛋白共培养时的生物活性。结果显示:作者制备的支架材料具有纵行的、平行排列的微管结构,Schwann细胞在支架材料微管内成线性平行排列,类似于神经基底膜与Schwann细胞形成的Büngner带;台盼蓝染色Schwann细胞死亡率仅6. 47%,MTT法证明Schwann细胞与硫酸肝素-胶原蛋白材料共培养时保有高度的生物活性。本研究结果表明:以硫酸肝素复合胶原蛋白结合特定条件下冷冻干燥技术可以制备在组分和内部空间结构上高度仿生神经的新型神经组织工程支架材料,与Schwann细胞有良好的细胞相容性。     

中线腰椎椎间融合术与微创通道下经椎间孔椎体间融合术单侧入路双侧减压治疗单节段腰椎管狭窄症的对比研究

【摘要】 目的：比较中线腰椎椎体间融合术（midline lumbar interbody fusion,MIDLIF）与微创通道下经椎间孔椎体间融合术（minimally invasive transforaminal lumbar interbody fusion,MIS-TLIF）单侧入路双侧减压治疗单节段腰椎管狭窄症的临床疗效。方法：回顾性分析2017年1月~2020年1月我院骨科采用MIDLIF技术与MIS-TLIF单侧入路双侧减压技术治疗的44例伴双侧症状的腰椎管狭窄症患者,其中L3-4 2例;L4-5 41例;L5-S1 1例。21例患者接受MIDLIF技术治疗,23例患者接受MIS-TLIF单侧入路双侧减压技术治疗。两组患者随访时间、性别无统计学差异（P＞0.05）;MIDLIF组年龄较MIS-TLIF组大（P＜0.05）。记录两组患者手术时间、下地时间、术中出血量、术后引流量、平均住院时间;于术前、术后1个月、3个月、6个月、12个月及末次随访采用视觉模拟评分法（visual analog scale,VAS）来评估腰痛及腿痛情况,术后6个月、12个月及末次随访采用腰椎Oswestry功能障碍指数（Oswestry disabity index,ODI）评定患者躯体功能、行走等整体生活质量。通过腰椎三维CT比较两组患者术前及末次随访时椎管横截面积（intervertebral canal cross-sectional area,ICCA）和硬膜囊横截面积 （dural sac cross-sectional area,DSCA）,术前及末次随访时腰椎正侧位X线片比较椎间隙高度（椎间隙前侧、后侧及平均高度）,并记录相关并发症。结果：44例患者均顺利完成手术。MIDLIF组出现1例脑脊液漏;MIS-TLIF组术后出现1例对侧神经症状加重患者;2例患者经对症处理后均好转。随访时间22~28个月,平均26.5个月。末次随访时44例植骨均融合,未出现内固定松动或断裂等情况。两组术后平均下地时间、平均住院时间无统计学差异（P＞0.05）;MIDLIF组手术时间（159.74±30.54min）比MIS-TLIF组（202.46±61.56min）短,有统计学差异（P＜0.05）;MIS-TLIF组术后引流量（55.35±53.24ml）比MIDLIF组（163.74±145.67ml）少,有统计学差异（P＜0.05）;两组患者术前腰痛及腿痛VAS评分及DOI无统计学差异（P＞0.05）;两组术后1个月、3个月、6个月、12个月及末次随访腰痛及腿痛VAS评分较术前降低,有统计学差异（P＜0.05）;术后两组间各时间点比较均无统计学差异（P＞0.05）。两组术后6个月、12个月及末次随访腰椎ODI较术前均降低,有统计学差异（P＜0.05）;术后两组间各时间点比较均无统计学差异（P＞0.05）;两组间术前ICCA、DSCA无统计学差异（P＞0.05）;两组患者术后ICCA、DSCA较术前均明显增大,有统计学差异（P＜0.05）,且MIDLIF组ICCA（184.42±46.74mm2）较MIS-TLIF组（135.54±42.63mm2）增大更明显;两组术后椎间隙前侧及平均高度均较术前明显增高（P＜0.05）,术后椎间隙前侧及平均高度无统计学差异（P＞0.05）,术后椎间隙后侧高度有统计学差异（P＜0.05）。结论：MIDLIF和MIS-TLIF单侧入路双侧减压治疗双侧症状的腰椎管狭窄症患者临床疗效确切,且MIDLIF技术手术时间相对更少,术后ICCA增大更多。MIDLIF技术减压更广泛、更直接。     

坐高与站高的比率和青少年特发性脊柱侧弯关系的分析

目的探讨青少年特发性脊柱侧弯患儿坐高与站高的比率是否和侧弯角度大小之间存在相关关系,并依据这一关系建立预测侧弯角度大小的数学方程。方法对46例轻、中度青少年特发性脊柱侧弯患儿进行观察分析,男8例,女38例;年龄10-20岁,平均13．8岁;单弯。测量记录患儿初次就诊时的实足年龄、站高、坐高以及Cobb角的大小,并根据对患儿站高、坐高测量记录的数据,分别计算每位患儿坐高与站高的比率。结果46例患儿的坐高66．00-88．80 cm(x±s,80．54 cm±5．75 cm);站高126．00-174．80 cm(x±s,153．67 cm±10.72 cm);坐高与站高的比例0．50-0．55(x±s,0．52±0．01);Cobb角10°-45°(x±s,25．70°±9．66°)。患儿的实足年龄、坐高、站高和Cobb角之间均没有相关关系(r分别为0．147,0．015,-0．106;P>0．05);而患儿的坐高与站高的比率和Cobb角之间存在明显的正相关关系(r=0．675;P<0．05);并根据这一关系建立了预测轻、中度青少年特发性脊柱侧弯侧弯角度大小的数学方程。结论青少年特发性脊柱侧弯患儿坐高与站高的比率和侧弯角度大小之间存在明显的正相关关系,可以依据坐高与站高的比率预测轻、中度青少年特发性脊柱侧弯患儿侧弯角度的大小。     

术前三维影像测量结合激光导航器辅助穿刺行经椎间孔入路经皮内窥镜下椎间盘切除术

目的探索术前三维影像测量结合自行研制的激光导航器辅助穿刺行经椎间孔入路经皮内窥镜下椎间盘切除术(PETD)的临床效果。方法 2016年3月—2017年8月,共57例腰椎椎间盘突出症(LDH)患者接受PETD治疗,32例患者采用传统穿刺方式行PETD(对照组);25例患者采用激光导航器辅助穿刺行PETD(试验组)。术中记录穿刺次数、手术时间、透视次数及患者术中疼痛视觉模拟量表(VAS)评分,并进行比较。结果试验组穿刺次数、透视次数、手术时间及术中腰痛VAS评分均明显低于对照组,差异有统计学意义(P 0.05)。2组术后VAS评分与术前相比均明显改善,差异有统计学意义(P 0.05)。结论激光导航器结合三维影像测量辅助穿刺,能够有效减少PETD的穿刺次数、透视次数及手术时间,手术效果良好,可减少患者术中长期俯卧产生的不适感,降低医患人员辐射暴露剂量,间接降低PETD的学习曲线。     

原子力显微镜下观察急性压力损伤后脊髓背根神经节神经元的结构变化

目的:利用脊髓背根神经节神经元细胞体外机械压力损伤模型,探计单纯机械压力因素对背根神经节神经元细胞的损伤效应,尤其是细胞膜骨架蛋白的变化情况。方法:新生SD大鼠脊髓背根神经节神经元体外原代培养,利用多功能全自动细胞压力仪(国家实用新型专利ZL 200820030390.7),将培养细胞分为A、B、C、D四组,其中A组为未施加机械压力损伤的对照组,B、C、D组分别给予0.3mPa、0.5mPa.、0.7mPa的压力损伤10min,每组观察细胞爬片6个,于加压后培养8h取细胞爬片固定,送原子力显微镜检测,观察神经元细胞的细胞膜骨架蛋白纳米级变化情况,获取并分析胞膜表面颗粒高度分布数据及原子力显微镜图片。结果:对照组细胞膜表面平滑,无明显粗糙颗粒;0.3mPa组细胞膜表面颗粒突起较对照组增多,膜颗粒总体高度增加,局部变粗糙,胞膜上蛋白高度分布直方图峰值右移;0.5mPa组较0.3mPa组胞膜粗糙度更加明显;0.7mPa组膜表面蛋白颗粒总体高度较0.3mPa及0.5mPa组降低,粗糙颗粒减少,但出现胞膜骨架蛋白解聚与构像变化,胞膜出现孔道样改变。胞膜颗粒高度分布峰值、分布宽度及最高颗粒值的单因素方差分析显示,压力损伤各组间及损伤组与对照组均有统计学差异(P<0.01)。结论:机械压力损伤因素可引起细胞膜骨架蛋白变化和表面颗粒高度变化,为压力损伤的细胞保护研究提供了实验数据。     

脊髓爆震伤后神经细胞的形态学变化及凋亡细胞的时空分布特点

目的:研究脊髓爆震伤后神经细胞的形态学变化及凋亡细胞的时空分布特点.方法:90只家兔随机分为正常组(A组,n=6)、Allen's撞击组(B组,n=42)和爆震损伤组(C组,n=42).用改良Allen's法造成B组不完全性急性脊髓损伤模型;而用0.7g单质金属炸药黑索金(cyclotrimethylene trinitramine)在垂直距离动物T9～T10节段4cm处引爆造成C组脊髓爆震伤模型,5h后B、C组动物均用诱发电位仪刺激下肢的MEP以筛选造模成功的动物.B、C两组分别于损伤后8h、1d、3d、7d、14d和30d取材(损伤段脊髓2cm).每组每个时间点取材7只,而A组动物不作任何处理,统一于30d取材.通过HE染色、透射电镜检测、DNA电泳分析和凋亡细胞原位末端标记法(TUNEL),观察各组脊髓中神经细胞的形态学变化及凋亡细胞的时空分布.结果:HE染色显示,A组为正常组织学表现;B组损伤后8h即出现大片的出血坏死灶,白质呈严重的脱髓鞘样改变,1、3d时前角运动神经元大量减少,7d时白质中空洞形成,而且空洞逐渐融合.到14、30d时,可见部分巨大空洞:而C组爆震后8h仅出现散在的小型出血点,但病变进展迅速,1d时前角运动神经元即明显减少并伴有大量微型空洞形成,3、7d时整个白质结构松散,可见液化坏死灶及广泛的脱髓鞘样改变,而且透射电镜证实这种髓鞘损伤还具有方向性特征,到14、30d时,脊髓可见巨大空洞及散在的小空洞,但面积明显小于B组.B组的前角运动神经元数目在8h时的降低幅度比C组要大(P＜0.05),而到损伤7d后.两组却无明显差异.DNA电泳显示B、C两组损伤后3d均出现明显的DNA梯形条带和Smearing现象,而且这种现象逐渐向邻近节段扩散.TUNEL检测显示,B、C两组于损伤后的灰质和白质中均能检测到阳性细胞,而且分布于灰质内的阳性细胞数均于1d时达到高峰(P＜0.001),但是在白质内的阳性细胞数量,B组于3d时达到高峰(P＜0.001),C组却于7d时才达到高峰(P＜0.001).结论:与脊髓Allen's撞击模型相比,脊髓爆震伤后同样存在神经细胞的凋亡现象,而且有其时间和空间分布特点.