基于药物代谢酶的中药十八反研究

“十八反”是中药药性理论的重要组成部分,是古今临床医家用药配伍禁忌的核心内容,几千年来指导和影响着中医临床安全用药。随着人类社会的进步和对医疗健康的需求不断提高,中药安全性问题日益受到社会广泛关注,而“十八反”则是目前中药安全性研究亟待解决的关键科学问题。“十八反”中药反与不反的客观界定及其科学本质的阐明,对完善中药配伍禁忌理论,丰富和发展中药配伍理论体系具有重大意义。细胞色素P450 酶作为人体重要的玉相药物代谢酶系统,对药物代谢和药物之间的相互作用有着重要影响。中药以合并用药为主且其中许多成分或许为P450 酶的底物、诱导剂或抑制剂,因此有可能存在基于P450 酶的中药相互作用。本课题组将现代药理学中药物相互作用的分子基础P450 酶引入中药相互作用的研究,对十八反中各组药物与药物代谢酶的关系进行了较系统的研究,为揭示一类基于药物代谢酶的中药相互作用模式,阐明中药配伍产生相反作用的分子机制和中药十八反配伍禁忌的科学内涵提供了实验依据。     

决明子水提液对大鼠肝脏CYP450酶的影响

该文研究决明子水提液对大鼠肝脏CYP450酶酶活性、mRNA及蛋白表达水平的影响。取SD大鼠,口服灌胃受试药物后,处死,用冰冷生理盐水灌流肝脏,提取大鼠肝脏微粒体、肝脏总RNA和总蛋白,采用Cocktail体外孵育法结合液质联用(LCMS)技术对大鼠肝脏中CYP1A2,2B1,2C11,2D2,2E1,3A1各亚酶的酶活性进行测定,并应用荧光定量PCR技术和Western blot对上述亚型的mRNA和蛋白表达水平进行检测。结果表明,酶活性方面,决明子水提液组与空白组比较可明显诱导CYP1A2,2B1,2C11,2D2,2E1,3A1的酶活性,其中决明子低剂量组对CYP2D2有明显的抑制作用,中、高剂量组对CYP2D2有明显的诱导作用,且都呈剂量依赖性增加,但对CYP3A1的诱导不呈剂量依赖性;mRNA表达方面,决明子水提液对CYP1A2,2C11,2D2,2E1mRNA的表达具有显著诱导作用,其中对CYP1A2,2D2,2E1诱导作用呈剂量依赖性,与酶活性水平具有一致性,对CYP2B1,3A1没有明显作用;蛋白表达方面,决明子水提液对CYP2C11,2E1的表达也具有诱导作用,但没有统计学差异。决明子水提液对CYP450同工酶不同程度诱导或抑制作用,特别是对于CYP2C11,2E1亚型酶,酶活性与mRNA,蛋白表达水平具有一致性,提示当与这些酶底物合并用药时,尤其是与CYP2C11,2E1代谢有关的药物合用时,应充分考虑到潜在的有益和不利的药物相互作用。     

3D HepG2细胞药物肝毒性评价模型的建立及其在药物安全性评价中的应用

该研究采用磁悬浮3维(3D)培养技术建立了3D Hep G2细胞评价模型,并应用此模型对典型的肝毒性药物进行了简单评价。Hep G2细胞形成稳定3D结构后,采用免疫组化技术检测了Hep G2细胞在2D,3D培养条件下的糖原储存能力,并应用RT-PCR技术对比研究了Hep G2细胞在2D,3D不同培养条件下Ⅰ相、Ⅱ相药物代谢酶、药物转运体、核受体及肝细胞特异标志性分子白蛋白(ALB)等相关基因的mRNA表达水平。免疫组化结果显示,Hep G2细胞在3D培养条件下具有丰富的糖原储存能力,此特性与人肝组织相类似。此外,在3D培养条件下,Hep G2细胞绝大部分药物代谢酶、转运体、核受体及ALB的mRNA表达水平与2D相比均有不同程度的上调。在药物肝毒性评价方面,该实验选用了典型的肝毒性药物对乙酰氨基酚(APAP)和近年来肝毒性报道较多的中药何首乌Polygonum multiflorum Thunb.及补骨脂Psoraleae corylifolia L.进行单剂量和重复剂量(7 d)给药实验;在重复剂量给药实验中,3D Hep G2细胞表现出更高的敏感性。应用磁悬浮3D培养技术建立的3D Hep G2细胞模型无论在形态上还是功能上都更接近于人的肝组织,是较好的3D肝毒性评价模型。     

三种脾虚泄泻证模型大鼠消化系统功能改变的比较

目的:运用番泻叶法、乙酸法和番泻叶加乙酸法分别制作三种大鼠中医脾虚泄泻证模型,比较所受损伤对消化及免疫系统功能等的影响,以期从中选择出与中医临床脾虚泄泻证较为吻合的动物模型来评价相关的治疗药物。方法:实验于2005-08在解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理毒理研究室完成。健康SD大鼠48只,随机分为对照组、番泻叶组、乙酸组和番泻叶加乙酸组,每组12只。番泻叶组灌服20%番泻叶浸剂4g/(kg·d),连续7dR乙酸组在实验第5天起禁食不禁水32h,由肛门(深入8cm)注入8%的乙酸0.5mL,捏紧大鼠肛门,倒提20s。番泻叶加乙酸组同番泻叶组灌服番泻叶浸剂7dR并在实验第5天注入8%的乙酸,余同乙酸组。对照组灌服、注入均为生理盐水,操作同番泻叶加乙酸组。观察各组大鼠一般症状,测定稀便率、体质量、脾脏指数、胸腺指数、血清D-木糖含量、血清淀粉酶活性、血清琥珀酸脱氢酶比活性等指标。结果:实验大鼠48只均进入结果分析。①三种大鼠脾虚泄泻证模型均出现腹泻、体质量下降、畏寒、倦怠等类似临床脾虚泄泻证一般症状的表现。②各组大鼠造模后体质量:对照组大鼠造模后体质量与造模前比较有显著增长;三个模型组造模后明显低于对照组[对照组(202.99±13.15)g,番泻叶组(143.84±5.66)g,乙酸组(157.07±11.83)g,番泻叶加乙酸组(127.64±14.32)g,P<0.01]。③各组大鼠胸腺质量、胸腺指数、脾质量、脾脏指数变化:各模型组胸腺质量和胸腺指数变化与对照组比较均有显著差异,脾质量和脾脏指数变化与对照组相比,只有番泻叶加乙酸组两者差异都有显著性[胸腺指数:对照组(0.0021±0.0005)、番泻叶组(0.0010±0.0002)、乙酸组(0.0013±0.0006)和番泻叶加乙酸组(0.0006±0.0003);脾脏指数:番泻叶加乙酸组(0.0013±0.0007),P<0.01]。④各组大鼠肠道病理:肉眼观察和病理切片均可见三种脾虚泄泻证模型大鼠肠道损伤,其中番泻叶加乙酸组最明显。⑤各组大鼠血清指标:各模型组血清D-木糖含量、淀粉酶活性、琥珀酸脱氢酶比活性均比对照组低[对照组、番泻叶组、乙酸组、番泻叶加乙酸组D-木糖含量分别为(0.4078±0.0632),(0.1993±0.0608),(0.2232±0.0338),(0.1947±0.0454)mmol/L;淀粉酶活性分别为(21.48±3.65),(16.74±3.06),(18.63±2.42),(14.00±1.47)μkat/L;琥珀酸脱氢酶比活性分别为(466.93±90.18),(221.38±42.51),(290.56±67.18),(215.54±69.51)μkat/L,P<0.01或P<0.05]。结论:与对照组比较,番泻叶加乙酸组所有指标变化最明显,并与临床上脾虚泄泻证的证候及客观指标变化吻合,可用这种复合造模模型来评价相关治疗药物。     

甘遂配伍甘草对大鼠肝脏CYP3A2影响

目的: 研究中药"十八反"中甘遂与甘草配伍对大鼠肝脏CYP3A2在mRNA 水平、蛋白表达及酶活性方面的调控作用.方法: RT-PCR 检测大鼠肝脏CYP3A2 mRNA水平;Western Blotting 检测大鼠肝脏CYP3A2蛋白表达;通过红霉素N-去甲基反应评价CYP3A2酶活性.结果: 在mRNA水平、蛋白表达、酶活性方面,甘遂单用组均高于其他组.结论: 甘遂、甘草可能存在基于药物代谢酶机制的药物间相互作用.     

阿魏酸及衍生物对γ射线照射小鼠活存率的影响

目的检测阿魏酸系列衍生物对8.5 Gy照射小鼠活存率的影响,以确定候选化合物。方法 ICR小鼠分为模型组、阳性药WR2721组、茜草双酯片组、阿魏酸、阿魏酸钠、5-溴阿魏酸及5-溴阿魏酸钠4种受试药高、中、低剂量组。观察药物对8.5 Gy照射小鼠活存率和死亡鼠平均活存时间的影响。结果照射对照组动物在14 d内全部死亡,阿魏酸系列衍生物可以显著提高8.5 Gy照射小鼠活存率,延长死亡鼠平均活存时间。结论阿魏酸钠对8.5 Gy照射小鼠活存效果较好,可考虑作为抗辐射药物做进一步研究。     

大鼠严重体表烫伤后心脏β－肾上腺素能受体腺苷酸环化酶系统的变化

大鼠背部３０％体表面积皮肤三度烫伤后３、６、１２、２４、４８ｈ，心肌ｃＡＭＰ含量分别减少１７．１％、２４．７％、３８．１％、３４．２％、２５．６％（Ｐ＜０．０５或０．０１）；心肌腺苷酸环化酶（ＡＣ）基础活性分别降低３２．７％、４２．３％、５７．７％、４６．２％、４０．４％（Ｐ＜０．０５或０．０１）；心肌磷酸二酯酶活性无明显变化；β－肾上腺素能受体（β－ＡＲ）密度明显降低（下调），但亲和力无明显变化。相关分析表明，ｃＡＭＰ含量的减少与ＡＣ活性降低呈显著正相关。实验还发现，烫伤后３、６ｈ，心肌膜ＡＣ基础活性及异丙肾上腺素（Ｉｓｏ）刺激活性均明显降低，而氟化钠（ＮａＦ）和法司可林（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ，ＦＳＫ），刺激活性无明显变化，提示此时ＡＣ活性降低主要由β－ＡＲ下调所致。烫伤后１２、２４、４８ｈ．ＡＣ基础活性和Ｉｓｏ刺激活性降低更为明显，ＮａＦ刺激活性也显著降低，但ＦＳＫ刺激活性仍无变化，提示此时ＡＣ活性的降低与β－ＡＲ下调和Ｇ－蛋白偶联ＡＣ催化亚基的功能障碍有关。上述β－ＡＲ－ＡＣ系统功能的减低是体表烫伤后心功能障碍的重要机制之一。     

四物汤及其提取物对辐射致血虚证小鼠造血作用的研究

[目的]探讨四物汤及其提取物治疗辐射致血虚证小鼠的作用机制和有效物质基础。[方法]γ射线全身照射小鼠制成血虚证模型,观察四物汤对其外周血和造血祖细胞集落的影响,基因芯片检测有效单体芍药苷的分子作用机制。[结果]四物汤、正丁醇提取物、水溶提取物对血虚证小鼠外周的白细胞的恢复有明显促进作用;四物汤和芍药苷增强血虚证小鼠骨髓造血干祖细胞的集落形成能力;芍药苷可促进骨髓基质细胞分泌造血因子(G-CSF,GM-CSF,PDGF-α)等,抑制造血抑制因子(M-CIP)的分泌。[结论]四物汤补血的物质基础可能是芍药苷,促进骨髓基质细胞分泌G-CSF,GM-CSF,PDGF-α等造血因子可能是四物汤补血的作用机制之一。     

复方丹参片对冠心病患者血浆蛋白影响的蛋白质组学研究

目的:用蛋白质组学技术考察复方丹参片对冠心病患者血浆蛋白的影响,在分子水平上探讨复方丹参片活血化瘀的作用机制。方法:收集正常、冠心病患者和复方丹参片用药病人组的血浆,用二向电泳、图像分析、质谱鉴定等蛋白质组学技术测定复方丹参片对冠心病患者血浆中有影响的蛋白质。结果:蛋白质组学研究发现,冠心病病人血浆与正常相比有3个蛋白质下调和6个蛋白质上调,复方丹参片可使这些改变的蛋白质水平有所恢复。胶内酶切提取蛋白进行质谱鉴定,其中冠心病病人血浆与正常相比升高的蛋白质有免疫球蛋白、纤维蛋白原、粒酶,冠心病病人血浆与正常相比降低的蛋白质有细胞表面糖蛋白(CD44SP)。冠心病病人服用复方丹参片后可降低免疫球蛋白、纤维蛋白原、粒酶。结论:复方丹参片可以降低冠心病患者血浆中的纤维蛋白原和粒酶,其可能通过抑制单核细胞黏附、平滑肌细胞增殖和迁移、减轻炎症而治疗冠状动脉粥样硬化。     

半楼贝蔹及配伍乌头对大鼠肝细胞色素P450酶含量的影响

[目的]研究中药十八反中半夏、贝母、栝楼、白蔹、白及配伍乌头对大鼠肝细胞色素P450 酶含量的影响。[方法]采用紫外分光光度测定大鼠肝微粒体细胞色素P450与细胞色素b5含量。[结果]配伍组与其相应单药组比较可显著降低P450酶及b5含量(P<0.001或P<0.05)。[结论]药物配伍后导致P450酶变化 ,对药物的代谢产生影响。