遗传病二代测序临床检测全流程规范化共识探讨(2)——样品采集处理及检测

二代测序技术(next generation sequencing,NGS)具有极高的检测通量,相对低的检测成本,高度的准确性(accuracy)和精准性(precision),是遗传病临床检测的有力工具之一。NGS实验室的检测流程是否规范,将直接影响NGS数据的稳定性、可靠性和有效性,将决定其是否能被用于遗传病的临床辅助诊断或筛查。因此.作为遗传病基因检测的重要环节之一,NGS实验室中流程的规范化与标准化非常重要。2019年5月,在第二届基因检测联盟会议上,针对如何规范NGS检测流程,从事遗传病临床诊治、实验室检测以及第三方基因检测机构的专家进行了全面充分的讨论,旨在规范基于NGS的基因检测流程,对检测流程中的前、中、后三个阶段(包括样本采集/接收/保存、NGS建库、上机测序及数据质控)的操作与实施提出了专业性的指导意见,以规范NGS技术在遗传病基因检测领域中的应用。本文根据此次研讨会上各行业专家的讨论,总结并发布NGS实验室检测流程的规范共识,以促进NGS实验室流程的规范化和标准化,推进我国NGS实验室在遗传病基因检测领域的快速和专业化发展。     

一种基于双重PCR结合毛细管电泳验证转录组测序结果的新方法

目的：将双重PCR与毛细管电泳技术相结合,建立一种验证转录组测序结果的新方法。方法根据前期进行转录组测序的分析结果,挑选8个差异基因作为靶基因,分别使用双重PCR结合琼脂糖凝胶电泳、双重PCR结合毛细管电泳以及实时荧光定量PCR进行验证,比较三者的验证率。结果双重PCR结合琼脂糖凝胶电泳的验证率为50％;双重PCR结合毛细管电泳和实时荧光定量PCR的验证率均为100％。结论双重PCR结合毛细管电泳可作为转录组测序结果验证的一种有效方法。     

人类管家基因和非管家基因microRNA绑定密度的比较及与3′UTR进化保守性关系的分析

目的：该研究从整体水平比较microRNA（miRNA）对管家基因和非管家基因的调控差异并研究3′UTR的进化保守性与miRNA对两类基因调控差异之间的相关性。方法通过对3个基于序列的miRNA靶基因预测软件整合分析,并结合基于miRNA-靶基因的表达谱数据相关性分析,以获得miRNA对两类基因的调控情况,同时利用phastCons保守性分值对两类基因的3′UTR区域进行多物种进化分析。结果研究发现miRNA在管家基因的3′UTR上有显著地高密度绑定,管家基因的3′UTR区域具有相对较高的序列保守性。结论该研究结果突出了miRNA对管家基因表达调控的重要作用,对于重新理解miRNA对真核生物基因表达调控作用具有一定的参考价值。     

DNA解链温度（Tm）不同预测方法的比较

目的寻找最优的DNA解链温度（Tm）预测方法。方法使用12种Tm值预测方法计算来自文献中348个实测数据的Tm值,将每种方法预测值与实验标准值的差值进行四分位法作图,并计算各方法残差平方和的自然对数,排序后比较12种预测方法的优劣。结果使用最邻近法并结合SantaLucia 1998热力学参数表和Schildkraut1965盐浓度校正公式所预测的Tm值最接近实测数据。结论最邻近法是最准确的Tm值预测方法,而且当PCR引物的GC含量越接近于50%时,其预测准确率越高。     

TXT2DNA：基于DNA序列的文本编、解码及比对软件系统

TXT2DNA是由我们实验室新近设计完成的一个能够将汉字等文本信息编码为DNA序列并可将后者解码还原为文本信息,同时可提供基于DNA序列比对技术的文本数据分析软件系统。TXT2DNA通过建立包括汉字字符在内的多种语言字符与DNA序列之间的唯一对应关系,为每个字符分配Unicode（唯一序列码）,实现从文字字符到DNA序列的编码与解码功能,进而实现了DNA与汉字字符的互通。     

锚定多重PCR技术的建立及其在核酸相对分子质量标准制备中的应用

目的利用5＇端锚定引物及多重聚合酶链反应（PCR）技术建立高效、特异性扩增核酸片段的方法,并探讨其在核酸相对分子质量（Mr）标准（DNA标志物）制备中的应用。方法针对常用的pMD19-T载体（2692 bp）序列,利用命令行程序pd4marker.py,结合Primer3及多因素引物特异性评估软件MFEprimer,设计5＇端锚定的上游引物和7对扩增不同目的片段的下游引物;其次,以转化有pMD19-T载体的大肠杆菌DH5α菌液为模板,分别进行一至七重PCR扩增;并将扩增产物经2%琼脂糖凝胶分离及凝胶成像仪采集图像分析;最后,评估该方法在核酸Mr标准制备中的应用。结果制备了特异性较好的一至七重PCR扩增产物,可针对不同实验目的进行不同核酸Mr标准的制备。结论建立了一种快速、特异性扩增核酸片段的锚定多重PCR方法,可根据不同实验目的,快速制备出不同Mr标准大小的核酸片段,进一步拓展了PCR技术的应用范围。     

实时定量PCR阵列技术在规模化检测基因表达中的应用

实时定量PCR阵列技术（RQ-PCR-array）以实时定量PCR（RQ-PCR）技术为核心并结合阵列（array）技术,能够比较可靠、准确地检测信号转导、疾病相关通路等过程相关的基因表达图谱,在规模化检测基因表达方面具有高通量的显著优势,已广泛应用于基础研究和临床。如能够结合多重PCR技术,有可能进一步达到超高通量基因表达检测水平。本文对该技术在规模化检测基因表达中的研究进展进行综述。     

Docker技术在生物信息学中的应用

随着高通量测序、蛋白质组学等生物技术的迅猛发展,生物医学数据、生物信息学工具及分析应用需求均呈现出多样性和复杂性的特点。传统的生物信息计算环境如专用工作站、虚拟机等已无法较好地适应这一情况。Docker作为一种新兴的容器技术,具有轻量、开放和安全的优点,为分析和处理生物大数据提供了一种新的解决方案,得到生物信息学开发和应用人员越来越多的关注与使用。该文针对大数据时代下生物信息学工具开发、部署、应用的要求和特点,分析Docker技术在生物信息学中应用的优势,介绍了该技术在生物信息学中的具体应用案例,探讨其有待改进的方面以及未来发展趋势。