丙型肝炎病毒核心蛋白不同区段在HEK293T细胞内的定位

目的：为进一步探讨HCV核心蛋白致癌机制，观察了HCV核心蛋白不同区段在HEK293T细胞内的定位情况。方法：构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和不同长度核心蛋白区段融合表达的pEGFP-C1系列重组载体，对HEK293T细胞进行瞬时转染，并在激光扫描共聚焦显微镜下观察核心蛋白不同区段在细胞内的定位。结果：全长核心蛋白定位于细胞质；核心蛋白1-59aa区段完全定位于细胞核；50～140aa区段和1-140aa区段在细胞核和细胞质中均存在；130～191aa区段完全存在于细胞质中。结论：核心蛋白不同区段在细胞内的定位不同，将导致其参与细胞调节的途径和功能的不同。     

黄病毒衣壳蛋白研究进展

黄病毒科病毒是一类单股正链RNA病毒,其基因组包含一个长的开放读码框.编码约含3 400个氨基酸残基的聚蛋白分子.聚蛋白经蛋白酶剪切加工得到衣壳(capsid,C)蛋白、prM蛋白和包膜E蛋白三种结构蛋白以及至少7种非结构蛋白.黄病毒的衣壳蛋白是病毒颗粒的构成成分之一,以多拷贝的形式与单拷贝的病毒基因组RNA共同构成病毒的核衣壳结构.近年来对C蛋白的研究取得了一定进展,已发现其除形成核衣壳结构外,还具有其他功能,这些功能涉及病毒RNA复制、病毒与宿主的相互作用等方面.本文综述了C蛋白结构与功能研究的最新进展.     

登革1型病毒NS1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的重组表达登革1型病毒NS1蛋白并制备多克隆抗体。方法通过RT-PCR扩增编码登革1型病毒NS1蛋白的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)后经酶切测序鉴定,获得重组质粒pET-NS1。进一步使用IPTG诱导表达,经免疫印迹鉴定后,采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中纯化回收融合蛋白,并通过透析对目的蛋白进行复性;纯化复性后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光法测定抗体效价。结果成功构建了高效表达登革1型病毒NS1蛋白的原核表达载体,表达的重组NS1蛋白占菌体蛋白总量的50%以上,以包涵体形式存在;免疫印迹表明表达的重组NS1蛋白能够为登革病毒兔抗血清识别,纯化后纯度可达95%以上;免疫小鼠后获得了效价1∶1000的抗登革病毒NS1蛋白的鼠多克隆抗体。结论原核表达的重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,诱导产生的多克隆抗体能够有效识别天然NS1蛋白,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体的生物学功能奠定了基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在哺乳动物细胞中的相互作用

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在哺乳动物细胞中的相互作用。方法分别扩增HCV核心蛋白core及其结合蛋白HCBP6的cDNA片段,克隆入pGEM-T载体。测序正确后应用双杂交技术把目的片段分别插入哺乳动物细胞双杂交系统的表达质粒pBIND和pACT中构建重组载体。将构建的pBIND-core和pACT-HCBP6重组载体和报告质粒pG5luc共转染HepG2细胞,并设背景对照组(pBIND pACT)、阳性对照组(pBIND-Myod pACT-Id)、2个阴性对照组(pBIND-core pACT、pBIND pACT-HCBP6)和空白对照组。采用Dual-荧光检测系统和TurnerBiosystemsVeritas微孔板化学发光检测仪检测荧虫素酶活性。结果成功构建重组载体pBIND-core和pACT-HCBP6,共转染HepG2细胞之后,其荧虫素酶活性与海肾素酶活性的比值与各对照组相比有统计学差异(P≤0·05)。结论HCV核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在肝癌细胞系中确有一定的相互作用,为进一步阐明HCV核心蛋白在细胞凋亡及细胞恶变中的作用机制提供了新的思路。     

HCV包膜蛋白E2的表达及其抗原性的检测

为研究丙型肝炎病毒（HCV）包膜蛋白E2在原核细胞和真核细胞中的表达，并对表达蛋白的抗原性进行检测。将HCV E2区N端的一段基因分别克隆入原核表达载体pQE30和真核表达载体pEF1/HisC中进行E2蛋白的表达，采用ELISA和WB对表达蛋白的抗原性进行检测。结果在原核细胞和真核细胞中均表达了预期大小的蛋白，能同HCV感染者血清发生特异性反应。提示该段E2基因在原核表达系统和真核表达系统均能表达出具有抗原活性的蛋白，其中真核细胞表达的蛋白可被糖基化。     

西尼罗病毒Chin-01株5′非编码区（UTR）中复制相关元件的功能研究

目的研究西尼罗病毒Chin-01株5′非编码区(UTR)中复制相关元件的功能,为探讨该病毒基因组复制的分子机制提供理论依据。方法通过生物信息学分析,初步筛选出Chin-01株5′UTR中可能的复制相关位点,并构建相应的重组亚基因组突变体,然后以上此为模板,经体外RdRp活性分析及凝胶阻滞试验,观察NS5的RdRp活性及与突变体的结合能力,再将突变位点引入该病毒感染性全长cDNA克隆,初步观察突变体恢复病毒的生物学特性。结果5′UTR中第45-60位核苷酸缺失的突变体无法合成子链,与NS5的结合能力也显著降低。第8和9位核苷酸改变的突变体则丧失了合成子代RNA及与NS5的结合能力,第8、9、69和70位核苷酸突变后形成的结构恢复突变体则可以合成子链RNA,并可与NS5特异性结合。同时,第45-60位核苷酸缺失及第8和9位核苷酸突变的恢复病毒的增殖能力也显著降低。结论Chin-01株5′UTR中的第45-60位及第8、9、69和70位核苷酸维持的结构可能是该病毒基因组复制的关键位点。     

西尼罗病毒Chin-01株5''非编码区(UTR)中复制相关元件的功能研究

目的 研究西尼罗病毒Chin-01株5'非编码区(UTR)中复制相关元件的功能,为探讨该病毒基因组复制的分子机制提供理论依据.方法 通过生物信息学分析,初步筛选出Chin-01株5'UTR中可能的复制相关位点,并构建相应的重组亚基因组突变体,然后以上此为模板,经体外RdRp活性分析及凝胶阻滞试验,观察NS5的RdRp活性及与突变体的结合能力,再将突变位点引入该病毒感染性全长cDNA克隆,初步观察突变体恢复病毒的生物学特性.结果 5'UTR中第45-60位核苷酸缺失的突变体无法合成子链,与NS5的结合能力也显著降低.第8和9位核苷酸改变的突变体则丧失了合成子代RNA及与NS5的结合能力,第8、9、69和70位核苷酸突变后形成的结构恢复突变体则可以合成子链RNA,并可与NS5特异性结合.同时,第45-60位核苷酸缺失及第8和9位核苷酸突变的恢复病毒的增殖能力也显著降低.结论 Chin-01株5'UTR中的第45-60位及第8、9、69和70位核苷酸维持的结构可能是该病毒基因组复制的关键位点.     

抗丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的制备及免疫组织化学研究

目的 制备丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体并进行免疫组织化学研究。方法以大肠杆菌表达的重组丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白为固相抗原，利用抗原抗体亲和性结合的原理，从半合成的人源可变区噬菌体抗体库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验(ELISA)和DNA序列分析，获得HCV核心蛋白的人源单链抗体；用该抗体对7721转染全长HCV cDNA后筛选的阳性克隆细胞中的HCV核心蛋白抗原进行免疫组化鉴定。结果 ELISA结果表明，制备的HCV核心蛋白人源单链抗体能与HCV核心蛋白抗原特异性结合；免疫组化结果表明，该抗体能够特异性识别HCV核心蛋白抗原，与正常肝细胞无交叉反应。结论此法制备单链抗体方法简便，周期短，可为HCV核心蛋白病原的检测提供新的检测手段。     

丙型肝炎病毒E2蛋白结合蛋白的酵母双杂交筛选研究

HCV的包膜蛋白E2 (E2 )的生物学特性与HCV感染的慢性化和抗病毒免疫关系极为密切。为了进一步阐明这个多功能蛋白质与宿主蛋白的关系 ,采用酵母双杂交系统 3,在酵母细胞融合蛋白表达型人肝cDNA文库中进行筛选 ,得到 76个与E2特异性结合的阳性克隆 ,包括人类肝细胞癌相关抗原、硒结合蛋白、核苷传送系统、果糖磷酸激酶等 2 6种已知功能蛋白质基因和 14个未知功能基因。本研究结果为阐明E2在HCV致病中的作用提供了重要研究线索。     

登革病毒NS1蛋白研究进展

登革病毒感染可引起登革热及登革出血热/登革休克综合征,是热带与亚热带地区重要的公共卫生问题。登革病毒非结构蛋白NS1（nonstructural protein1）,在病毒感染、复制及病理过程中起着重要作用。该文综述了近年来登革病毒非结构蛋白NS1结构与功能的研究进展。     

乙型肝炎病毒大蛋白时间分辨荧光免疫分析法的建立及应用

目的 建立定量检测患者血清HBV-大蛋白（LP）的TRFIA.方法 以抗人HBV-LP单克隆抗体和抗HBs多克隆抗体分别作为固相抗体和铕标记抗体,应用TRFIA和ELISA对标准品、66份慢性乙型肝炎患者血清、30份健康体格检查者血清中HBV-LP进行检测.分析TRFIA和ELISA的有效检测范围等,统计学比较采用χ^2检验和直线相关分析.结果 标准品TRFIA检测结果示该法剂量-反应曲线呈良好线性相关（r=0.999）.ELISA法测得的正常（30份健康者血清）95％参考范围为0～1.36 mg/L.TRFIA灵敏度（最小测定值）为0.10 mg/L,30份健康血清HBV-LP的检测结果均正常,特异性100％.66份患者血清TRFIA与ELISA检测结果的r为0.800 9（P＜0.001）,两者检测的阳性率差异有统计学意义[89.4％ （59/66）与77.3％（51/66）,χ^2=6.13,P＜0.01].TRFIA有效可测范围（CV＜ 10％）为1.35～2 764.00 mg/L,ELISA为10.80～691.00 mg/L.TRFIA回收率范围为95.93％ ～ 107.62％.结论 TRFIA法检测患者血清中的HBV-LP灵敏度和特异性高,检测范围宽,对早期筛选HBV患者及监测抗病毒治疗的疗效具有潜在的价值.     

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A结合蛋白

目的 筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4A结合蛋白，为HCV致病机制的研究探索新的途径。方法 应用噬菌体展示技术，以HCV非结构蛋白NS4A作为固相筛选分子，对T7噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程，经噬斑的PCR扩增后，构建克隆载体，最后对所筛选克隆进行DNA序列测定和同源性分析。结果 噬菌体经富集后，从随机挑选的12个克隆中得到2个阳性克隆，成功构建了克隆载体。序列测定后经过序列同源性分析，确定了与HCV非结构蛋白NS4A结合的是肝细胞蛋白-丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)激活蛋白激酶5(MAPKAPK5)。结论 用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了HCV非结构蛋白NS4A的结合蛋白，为进一步研究HCV的致病机制奠定了良好的基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5B结合蛋白的酵母双杂交筛选研究

目前认为丙型肝炎病毒 (HCV)的非结构蛋白 5B(NS5B)是病毒复制酶 ,但是对其生物学特性还不十分清楚 ,我们应用酵母双杂交系统 3,构建NS5B诱饵质粒 ,转化酵母AH10 9,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合 ,于涂有X α gal营养缺陷型培养基(SD/ Trp Leu His Ade)上筛选生长。挑选蓝色克隆 ,筛选出 33个与NS5B特异性相互作用的克隆 ,其中有 31个已知功能基因及 2个未知功能基因。所克隆到的基因对以后研究NS5B的功能有一定的提示作用 ,并为研究这些能与NS5B相互作用的基因在肝细胞中的生理功能奠定了基础。     

乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1蛋白基因在原核细胞中的高效表达及其表达产物的抗原性分析

目的将乙型脑炎病毒NS1蛋白基因克隆至pET28-a( )表达载体,构建原核表达载体pET-NS1,并使该基因在E.coli中高效表达,为进一步研制乙脑早期诊断试剂奠定基础。方法根据GenBank中提供的乙型脑炎病毒SA14-14-2株全基因序列设计引物,通过反转录及巢式PCR方法扩增目的片段,测序后连接pET28-a( )载体,构建重组表达载体pET-NS1,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导获得高效表达。结果扩增出了1300bp的基因片段,与预期大小一致,测序后经Blast验证与已发表乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1蛋白基因序列同源性为100%,成功克隆至表达载体pET28-a( )并获得高效表达,表达产物分子量约为45kD,Western blot分析表明该表达产物具有良好抗原性。结论该表达产物的稳定高效表达及其抗原特异性为乙脑的诊断试剂开发提供了依据。     

丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达

目的 在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体。方法 采用噬菌体表面展示技术，将丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白单克隆抗体固相包被于Nunc板。从人源噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选，获得结合活性较强的人源HCV核心蛋白抗独特型(抗-Id)scFv阳性克隆。从阳性克隆中提取质粒，经SfiI／Not I酶切鉴定后，亚克隆到pCANTAB5E载体，转化大肠杆菌XL1-Blue，应用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达可溶性的HCV核心蛋白抗独特型单链可变区抗体。酶联免疫吸附法(ELISA)证实表达的HCV核心蛋白抗-Id scFv具有与HCV核心蛋白单克隆抗体反应的特异性。对转化的大肠杆菌XL1-Blue上清中表达的HCV核心蛋白抗-Id scFv进行硫酸铵沉淀，并进行SDS-PAGE电泳。结果 筛选得到的HCV核心蛋白抗-Id scFv片段基因由774bp组成。SDS-PAGE电泳表明，大肠杆菌XL1-Blue中表达的可溶性HCV核心蛋白抗-Id scFv分子量约28kD。结论 HCV核心蛋白抗-Id scFv与HCV核心蛋白抗-Id scFv单克隆抗体具有较强的结合活性和特异性。HCV核心蛋白抗-Id scFv的筛选和表达成功，为今后HCV核心蛋白抗-Id scFv的研究和应用奠定了基础。     

日本脑炎病毒非结构蛋白NS5对IFN-α介导的信号转导通路的抑制作用

目的探讨日本脑炎病毒抑制IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路过程中发挥关键作用的病毒特异蛋白,为阐明日本脑炎病毒抑制Ⅰ型IFN介导的JAK-STAT信号转导通路的作用机制奠定基础。方法分别构建日本脑炎病毒编码的7种非结构蛋白基因(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)的重组真核表达载体。采用间接免疫荧光法和Western blotting观察它们在细胞内的表达及定位情况。利用含萤火虫荧光素酶(Luc)报告基因的重组载体pISRE-Luc,观察表达病毒不同非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路的活化程度。构建融合表达红色荧光蛋白的STAT1重组真核表达载体pRed-STAT1,利用该重组载体在表达病毒非结构蛋白的细胞内观察融合蛋白Red-STAT1在IFN-α作用下的细胞内定位情况。同时,对表达病毒非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的STAT1分子的磷酸化水平进行检测。结果日本脑炎病毒的7种非结构蛋白均可在哺乳动物细胞内正确表达,而且表达蛋白均位于细胞质中。在这7种非结构蛋白中,NS5可阻断STAT1分子的核转运及抑制STAT1分子的磷酸化水平,从而抑制IFN-α介导的细胞内JAK-STAT信号转导通路的活化。结论日本脑炎病毒的非结构蛋白NS5对Ⅰ型IFN系统的信号转导通路具有显著的抑制作用,可能是一种Ⅰ型IFN系统的拮抗蛋白。     

含有RSV G蛋白片段和CTL表位融合蛋白的表达及纯化

目的：构建表达呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白片段(G126，来自100-225氨基酸)和来自：RSVM2蛋白的CTL表位的原核表达质粒，探索适宜的表达和纯化条件，获得融合表达产物，为进行体内外实验检测奠定基础。方法：利用PCR技术，从质粒puC18(G10)、puC18(CTL)中扩增G126和CTL基因，通过DNA重组技术构建含：DsbAG126-Linker-CTL(DsbA-GLC)融合基因的表达载体pET(GLC)。转化宿主菌E.coli BL21(DE3)plysS进行诱导表达，并采用亲和层析纯化目的蛋白。结果：DsbA-GLC在E．coli BL21(DE3)plysS中可获得高效表达，表达量可达菌体总蛋白的21％。通过可溶性测试，DsbA-GLC能以可溶性形式表达。纯化后目的蛋白的纯度可达到95％以上。结论：实现RSVG126和M2蛋白CTL表位的融合表达，所获得的重组蛋白可作为抗原用于RSV重组蛋白疫苗的筛选。     

鼠肝炎冠状病毒非结构蛋白1内保守序列LLRKxGxKG的功能研究

目的研究鼠肝炎冠状病毒(MHV)非结构蛋白1(NSP1)内的保守氨基酸序列LLRKxGxKG的功能。方法扩增并构建MHVNSP1正常基因及LLRKxGxKG序列缺失突变的NSP1基因,分别将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,获得真核表达质粒。用所构建的真核表达质粒转染L929细胞,经新城疫病毒(NDV)刺激诱导后,采用ELISA法检测IFN-β的表达水平,观察NSP1正常或突变蛋白对IFN-β表达的影响。通过与含CAT和Luc报告基因的重组质粒进行共转染,观察NSP1正常或突变蛋白对IFN-β启动子活性和干扰素刺激应答元件(ISRE)活性的影响。通过与三种报告基因(pRLuc-CMV、pGL3-basic、pGL3-control)共转染,观察NSP1正常或突变蛋白对共转染基因表达的影响。结果MHVNSP1对真核细胞产生干扰素有一定的影响,并可显著抑制IFN-β启动子或ISRE应答元件的活性,且该抑制作用不受LLRKxGxKG序列缺失的影响。同时,MHVNSP1还可强烈抑制多种共转染报告基因的表达。该抑制作用在LLRKxGxKG序列缺失后显著降低。结论MHVNSP1对Ⅰ型干扰素信号通路有特异的抑制作用。L...     

HCV核心蛋白诱导肝细胞侵袭性的体外研究

目的:探讨HCV核心蛋白对肝细胞侵袭性的影响.方法:构建HCV核心蛋白真核表达载体pIRES-core,稳定转染L02细胞,通过间接免疫荧光和Western印迹方法检测核心蛋白的表达,电镜观察肝细胞的形态变化,用体外迁移侵袭力实验测定转染HCV核心蛋白肝细胞的迁移侵袭的能力.结果:未转染细胞L02和转染空载体细胞相比,转染HCV核心蛋白细胞表达基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN)的水平升高,并且该细胞的迁移侵袭能力明显升高(P<0.01).结论:HCV核心蛋白可能通过上调EMMPRIN的表达以提高肝细胞的迁移侵袭能力,为进一步探讨核心蛋白如何诱导肝细胞侵袭性奠定了基础.     

生物大分子溶液结构的核磁共振测定法

随着高分辨核磁共振仪和多维核磁共振技术的快速发展，近年来高场核磁共振仪已成为测定生物大分子在溶液中的三维结构的最强有力的手段。目前已有１７００多个生物大分子的溶液结构用高分辨核磁共振技术进行了测定。该文简要综述了这一高新技术的特点，测定流程，并分析了若干实例。