胰腺癌Capan-2细胞与树突状细胞融合诱导特异性抗癌免疫应答的体外研究

目的观察人胰腺癌Capan-2细胞与树突状细胞(DC)融合后诱导的特异性抗肿瘤免疫反应。方法收集2013年4月-2015年3月于沈阳军区总医院消化科就诊的人类白细胞抗原(HLA)-A2~+胰腺癌患者6例,从患者外周血单个核细胞中分离并培养DC。所获DC分为3组:(1)使用聚乙二醇-二甲基亚砜诱导法,将DC与Capan-2细胞融合以负载肿瘤抗原;(2)DC与Capan-2细胞共培养;(3)单独DC培养。通过流式细胞术检测PE-MUC4/FITC-CD86抗体双标细胞评估融合率;应用四甲基偶氮唑盐法检测各组DC的存活率变化。使用干扰素(IFN)γ酶联免疫法检测DC诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)活化反应。采用51Cr标准细胞毒实验检测DC诱导的抗原特异性CTL对体外胰腺癌细胞的杀伤作用。多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果DC与Capan-2融合细胞同时表达DC表型(CD86)和MUC4分子,CD86与MUC4双阳性表达率为(38.30±7.30)%,明显高于共培养组(7.21±1.06)%;融合细胞组DC存活率呈时间依赖性下降,转染后96 h的存活率降低至62.81%,而与Capan-2细胞共培养组DC存活率稳定在80%以上,两组间差异有统计学意义(P0.05)。DC-Capan-2融合细胞诱导的CTL 24 h IFNγ释放量为(85.34±2.97)U/ml,DC、Capan-2共培养组DC诱导的IFNγ释放量为(19.07±4.25)U/ml,两转染组的差异有统计学意义(P0.05)。DC-Capan-2融合细胞诱导的特异性CTL能够有效识别和杀伤HLA-A2~+/MUC4~+的Capan-2细胞及HLAA2~+/MUC4-的PANC-1细胞,但不能有效识别和杀伤HLA-A2-/MUC4-的Mia Pa Ca-2细胞和HLA-A2-/MUC4~+的As PC-1细胞。结论胰腺癌细胞与DC融合后可诱导出显著的CTL抗肿瘤免疫反应,此过程受主要组织相容性复合体Ⅰ类抗原呈递的限制。     

胰腺癌相关抗原MUC1与survivin mRNA联合转染树突细胞激发特异性细胞毒T淋巴细胞能力的体外研究

目的 研究人胰腺癌MUC1与survivin mRNA联合转染树突细胞（DC）体外激发特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）的能力,为构建负载多抗原表位DC疫苗治疗胰腺癌提供实验依据.方法 自6例胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养并鉴定DC.常规培养人胰腺癌细胞株MiaPaCa-2,采用RT-PCR方法扩增MUC1和survivin mRNA.应用电穿孔法将两种mRNA单独或联合转染DC,分别命名为DC-MUC1、DC-survivin、DC-MUC1＋ survivin.采用实时定量PCR法检测DC的MUC1、survivin mRNA表达;四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测DC存活率;使用混合细胞培养法检测转染DC体外刺激自体T淋巴细胞的增殖能力;应用ELISA法检测转染DC体外激发抗原特异性CTL释放Th1型细胞因子IL-2、IL-10、granzyme B、IFN-γ的水平.结果 成功获得成熟的DC,成熟DC的表面标志物CD40、HLA-DR、CD83和CD86的阳性表达率分别为34.31％、50.21％、89.17％和73.62％.DC-MUC1的MUC1 mRNA表达量为36.24±5.17;DC-survivin的survivin mRNA表达量为34.53±4.02;DC-MUC1＋survivin的MUC1、survivin mRNA表达量分别为31.79±4.26和14.67±2.96,显著低于单转染的DC（P值均＜0.05）.DC-MUC1＋ survivin的存活率呈现时间依赖性下降,96 h时的存活率显著低于单转染DC（50.21％比80％左右,P值均＜0.05）.当作为刺激细胞的DC和作为效应细胞的T淋巴细胞比例为1∶10、1∶20时,DC-MUC1＋ survivin刺激自体T细胞的增殖指数显著高于单转染DC,差异有统计学意义（P值均＜0.05）;而比例为1∶40、1∶80时的增殖指数差异无统计学意义.当DC∶T为1∶10孵育14 d时,DC-MUC1、DC-survivin、DC-MUC1＋survivin的IL-2水平分别为（892.73±32.90）、（713.62±56.37）、（1884.37±95.21） pg/ml;granzyme B水平分别为（501.62±12.30）、（203.84±12.55）、（1193.15±86.04） pg/ml;IFN-γ水平分别为（981.50±47.82）、（696.05±41.66）、（2237.94±189.55） pg/ml.DC-MUC1＋ survivin显著高于单转染的DC,差异有统计学?     

双胰腺癌相关抗原RNA转染树突细胞诱导特异性抗癌免疫反应的实验研究

目的研究人胰腺癌MUC4与Survivin mRNA联合转染树突细胞(DC)诱导的特异性抗肿瘤免疫反应,为构建负载多抗原表位DC疫苗治疗胰腺癌提供实验依据。方法自胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养DCs。使用体外转录和胰腺癌PCR技术扩增MUC4和Survivin mRNA后用电穿孔法将其联合转染DC。采用Western blot技术检测DCs中MUC4和Survivin的表达。用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测转染前后DCs存活率变化;使用IFN-γ酶联免疫法检测MUC4 mRNA与Survivin mRNA联合转染后DC诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活化反应。采用51Cr标准细胞毒实验检测转染MUC4和Survivin mRNA后DCs诱导的特异性CTL对体外胰腺癌细胞的杀伤作用。结果 MUC4与Survivin mRNA联合转染后72 h DCs中两者的相对表达量低于其分别转染。顺序转染后96 h DCs存活率降至50.2%,低于MUC4 mRNA与Survivin mRNA分别转染时DC 80%的存活率(P0.05)。MUC4和Survivin mRNA联合转染DC诱导的特异性CTL 24 h IFN-γ释放量达(33.84±3.51)U/mL,高于MUC4与Survivin mRNA分别转染DC诱导的CTL IFN-γ释放水平[(21.87±4.12)U/mL和(16.61±2.09)U/mL,P0.05]。DCs经MUC4 mRNA与Survivin mRNA联合转染后,可有效诱导HLA-A2+/MUC4+/Survivin+特异性CTL免疫反应,对体外培养的胰腺癌细胞具有显著的杀伤作用。结论 MUC4与Survivin mRNA联合转染的DCs可较单胰腺癌相关抗原负载DCs诱导出更加显著的特异性CTL抗肿瘤免疫。     

胰腺癌细胞总RNA转染树突细胞诱导特异性CTL能力的体外研究

目的观察人胰腺癌Mia Pa Ca-2细胞总RNA电转染树突细胞(Dendritic Cell,DC)体外激发抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)的能力。方法自6例胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养DC。使用电穿孔法将Mia Pa Ca-2细胞总RNA体外转录和PCR扩增的MUC1m RNA转染DC,以未负载抗原的DC为对照。采用实时定量PCR技术检测各组DC中MUC1表达。四甲基偶氮唑盐(MTT)检测转染各组DC存活率变化;混合细胞培养法评价各组DC体外刺激自体T淋巴细胞增殖能力;ELISA法检测各组DC体外激发抗原特异性CTL细胞因子释放量。结果 Mia Pa Ca-2总RNA与MUC1 m RNA分别转染后48 h DC中目标抗原的相对表达量分别为37.24±3.17和34.53±2.02,两者比较无显著差异(P0.05)。电转染后96 h Mia Pa Ca-2总RNA转染组DC存活率降至60.81%,低于MUC1 m RNA单转染时DC的存活率(80%左右)(P0.05)。转染Mia Pa Ca-2总RNA DC刺激自体T细胞增殖指数为8 432±611.25,显著高于MUC1单独转染组3 664±305.17(P0.05);且转染Mia Pa Ca-2总RNA DC激发特异性CTL分泌IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-γ水平亦显著高于MUC1 m RNA单独转染组(P0.05)。结论胰腺癌肿瘤细胞总RNA转染的DC较单一胰腺癌相关抗原负载DC有更强的体外抗原特异性CTL激发能力。     

KAI1基因对人胰腺癌裸鼠种植瘤淋巴转移的影响

目的 探讨KAI1基因对裸鼠胰腺癌种植瘤淋巴结转移及淋巴管新生的作用.方法 建立裸鼠的人胰腺癌MiaPaCa-2细胞皮下种植瘤模型,成瘤后应用KAI1腺病毒(Ad-KAI1)瘤内注射治疗,每周1次,共3次,以瘤内注射腺病毒(Ad)或生理盐水组作为对照,记录肿瘤生长情况.成瘤50 d收集瘤体及肿大淋巴结,常规病理学检查,并采用免疫组化法检测瘤组织中淋巴管特异性标志物LYVE-1表达,计算微淋巴管密度(MLVD).结果 裸鼠接种MiaPaCa-2细胞2周后100％成瘤.生理盐水组、Ad组、Ad-KAI1组裸鼠种植瘤的生长速度无明显差异(P＞0.05);50 d后收集的瘤体重量分别为(2514.4 ±351.3)、(2466.1±295.5)、(2294.4±255.4) mg,组间差异无统计学意义.生理盐水组8只(80％)发现肿大淋巴结转移,共收集到肿大淋巴结20枚,平均2.0枚/只;Ad组7只(70％)发现肿大淋巴结,共收集到肿大淋巴结15枚,平均1.5枚/只;Ad-KAI1组4只(40％)发现肿大淋巴结,共收集到肿大淋巴结6枚,平均0.6枚/只.所有肿大淋巴结均经病理学检查确定为肿瘤的淋巴转移灶.3组裸鼠肿瘤淋巴结转移及每只裸鼠平均淋巴结转移数的差异均有统计学意义(F值分别为3.14、3.35,P值均＜0.05).生理盐水组、Ad组、Ad-KAI1组裸鼠胰腺癌种植瘤组织中MLVD分别为(18.70±5.60)、(19.40±4.58)、(9.80±4.10)个/400倍视野,Ad-KAI1组MLVD显著低于生理盐水组和Ad组,差异有统计学意义(F值分别为10.76、11.36,P值均＜0.05),而生理盐水组和Ad组间的差异无统计学意义.结论 KAI1可能通过减少裸鼠种植瘤组织中的淋巴管新生、降低微淋巴管密度来抑制胰腺癌的淋巴转移.     

KAI1基因转染对乏氧培养下胰腺癌MiaPaCa-2细胞增殖、迁移及VEGF表达的影响

目的 观察转染KAI1基因的人胰腺癌MiaPaCa-2细胞在乏氧条件下培养后细胞增殖、迁移、侵袭能力的变化,探讨其可能机制.方法 应用KAl1基因过表达质粒转染乏氧条件培养后的人胰腺癌MiaPaCa-2细胞,采用蛋白质印迹法检测转染细胞KAI1、VEGF-C、VEGF-A蛋白的表达,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测转染细胞的增殖,细胞划痕及Transwell小室实验观察转染细胞的迁移及侵袭能力,酶联免疫吸附测定法检测培养上清液中人VEGF-C、VEGF-A含量.结果 转染KAI1基因后的MiaPaCa-2-K细胞的KAI1蛋白表达量较未转染细胞显著增加[（0.549 ±0.021）比0].乏氧条件培养后转染细胞的增殖无明显变化,但它的迁移距离明显缩短,穿膜细胞数显著减少[（14.0±5.8）比（43.0±14.4）个,P＜0.05];细胞的VEGF-C表达显著降低[（0.218±0.043）比（0.745±0.069）.P＜0.05],但VEGF-A表达变化不显著;细胞培养上清液中VEGF-C含量显著减少[（1236±247）比（2045±221） pg/ml,P＜0.01].结论 转染KAl1基因的MiaPaCa-2细胞在乏氧条件下培养后的细胞迁移、侵袭能力减弱,其机制可能是通过下调VEGF-C的表达来抑制胰腺癌淋巴转移的.     

U(Ⅵ)吸附偕胺肟化聚丙烯腈薄膜的制备条件优化

目的 制备一种便于回收、重复使用的偕胺肟化聚丙烯腈(PAO)薄膜吸附剂,并优化制备条件.方法 以聚丙烯腈(PAN)粉末为原料,用非溶剂致相分离法制备了 PAO薄膜,研究不同制备条件下PAO薄膜对U(Ⅵ)的吸附性能,考察制备铸膜液时PAN浓度、偕胺肟化温度和时间以及吸附前碱处理对PAO薄膜对U(Ⅵ)吸附性能的影响.结果 ...