胰腺癌Capan-2细胞总RNA转染树突细胞诱导特异性抗肿瘤免疫反应的体外研究

目的 观察人胰腺癌Capan-2细胞总RNA转染的树突细胞（DCs）所诱导的抗肿瘤免疫反应.方法 从6例胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养DCs.使用电穿孔法将Capan-2细胞总RNA及MUC4 mRNA分别转染DCs.应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测转染后DCs的存活率.采用蛋白质印迹法检测DCs中MUC4 mRNA的表达.使用IFN-γ酶联免疫法检测DCs诱导的细胞毒T淋巴细胞（CTLs）的活化反应.采用51Cr标准细胞毒实验检测DCs诱导的抗原特异性CTLs对体外胰腺癌细胞的杀伤效应.结果 Capan-2细胞总RNA转染的DCs（DC-Capan-2-total RNA）的存活率呈时间依赖性下降,转染后96 h的存活率降低至60.8％,而转染MUC4 mRNA的DCs（DC-MUC4 mRNA）的存活率稳定在80.0％左右,两转染组DCs的差异具有统计学意义（P＜0.05）.DC-Capan-2-total RNA的MUC4蛋白表达量亦显著低于DC-MUC4 mRNA（P＜0.05）.DC-Capan-2-total RNA诱导的CTLs 24 h IFN-γ释放量为（89.34±3.85） U/ml,DC-MUC4 mRNA为（21.77±2.14） U/ml,两转染组的差异有统计学意义（P＜0.05）.DC-Capan-2-total RNA诱导的特异性CTLs能够有效识别和杀伤HLA-A2 ＋/MUC4＋的Capan-2细胞及HLA-A2 ＋/MUC4-的PANC1细胞,而不能有效识别和杀伤HLA-A2-/MUC4-的MiaPaCa-2细胞和HLA-A2-/MUC4＋的AsPC-1细胞.结论 胰腺癌细胞总RNA转染的DCs较单个胰腺癌相关抗原转染的DCs能诱导出更加显著的CTLs抗肿瘤免疫反应,但受到MHC Ⅰ类抗原递呈的限制.     

胰腺癌细胞总RNA转染树突细胞诱导特异性CTL能力的体外研究

目的观察人胰腺癌Mia Pa Ca-2细胞总RNA电转染树突细胞(Dendritic Cell,DC)体外激发抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)的能力。方法自6例胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养DC。使用电穿孔法将Mia Pa Ca-2细胞总RNA体外转录和PCR扩增的MUC1m RNA转染DC,以未负载抗原的DC为对照。采用实时定量PCR技术检测各组DC中MUC1表达。四甲基偶氮唑盐(MTT)检测转染各组DC存活率变化;混合细胞培养法评价各组DC体外刺激自体T淋巴细胞增殖能力;ELISA法检测各组DC体外激发抗原特异性CTL细胞因子释放量。结果 Mia Pa Ca-2总RNA与MUC1 m RNA分别转染后48 h DC中目标抗原的相对表达量分别为37.24±3.17和34.53±2.02,两者比较无显著差异(P0.05)。电转染后96 h Mia Pa Ca-2总RNA转染组DC存活率降至60.81%,低于MUC1 m RNA单转染时DC的存活率(80%左右)(P0.05)。转染Mia Pa Ca-2总RNA DC刺激自体T细胞增殖指数为8 432±611.25,显著高于MUC1单独转染组3 664±305.17(P0.05);且转染Mia Pa Ca-2总RNA DC激发特异性CTL分泌IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-γ水平亦显著高于MUC1 m RNA单独转染组(P0.05)。结论胰腺癌肿瘤细胞总RNA转染的DC较单一胰腺癌相关抗原负载DC有更强的体外抗原特异性CTL激发能力。     

双胰腺癌相关抗原RNA转染树突细胞诱导特异性抗癌免疫反应的实验研究

目的研究人胰腺癌MUC4与Survivin mRNA联合转染树突细胞(DC)诱导的特异性抗肿瘤免疫反应,为构建负载多抗原表位DC疫苗治疗胰腺癌提供实验依据。方法自胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养DCs。使用体外转录和胰腺癌PCR技术扩增MUC4和Survivin mRNA后用电穿孔法将其联合转染DC。采用Western blot技术检测DCs中MUC4和Survivin的表达。用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测转染前后DCs存活率变化;使用IFN-γ酶联免疫法检测MUC4 mRNA与Survivin mRNA联合转染后DC诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活化反应。采用51Cr标准细胞毒实验检测转染MUC4和Survivin mRNA后DCs诱导的特异性CTL对体外胰腺癌细胞的杀伤作用。结果 MUC4与Survivin mRNA联合转染后72 h DCs中两者的相对表达量低于其分别转染。顺序转染后96 h DCs存活率降至50.2%,低于MUC4 mRNA与Survivin mRNA分别转染时DC 80%的存活率(P0.05)。MUC4和Survivin mRNA联合转染DC诱导的特异性CTL 24 h IFN-γ释放量达(33.84±3.51)U/mL,高于MUC4与Survivin mRNA分别转染DC诱导的CTL IFN-γ释放水平[(21.87±4.12)U/mL和(16.61±2.09)U/mL,P0.05]。DCs经MUC4 mRNA与Survivin mRNA联合转染后,可有效诱导HLA-A2+/MUC4+/Survivin+特异性CTL免疫反应,对体外培养的胰腺癌细胞具有显著的杀伤作用。结论 MUC4与Survivin mRNA联合转染的DCs可较单胰腺癌相关抗原负载DCs诱导出更加显著的特异性CTL抗肿瘤免疫。     

胰腺癌MUC1 mRNA转染树突细胞疫苗诱导特异性抗肿瘤的免疫反应

目的 研究人胰腺癌MUC1 mRNA转染树突细胞(DC)诱导的特异性抗肿瘤免疫反应,为DC疫苗治疗胰腺癌提供实验依据.方法 从外周血中分离单核细胞(PBMC)并培养成DC,从细胞形态和表面标志进行鉴定.通过RT-PCR扩增胰腺癌MiaPaCa-2细胞的MUC1 mRNA后用电穿孔法将其转染DC.采用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测培养不同时间点DC的MUC1的表达.用四甲基偶氮唑蓝法检测DC存活率.采用51Cr标准细胞毒实验观察转染MUC1 mRNA的DC诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应;应用ELASA法检测CTL的IFN-γ释放量.结果 培养获得的细胞呈现典型的DC形态特征和表面标志(CD40+、HLA-DR+、CD83+、CD86+).MUC1 mRNA转染DC48 h后,细胞MUC1 mRNA表达水平最高,为38.43(36.89 ～48.06),蛋白表达亦最强.转染后DC的存活率稳定在80％左右.转染MUC1 mRNA的DC可有效诱导HLA-A2 +/MUC+特异性CTL免疫反应;胰腺癌Capan-2细胞与转染MUC1的DC刺激MUC1特异性CTL的24 h IFN-γ释放量分别为(28.44±4.96)和(16.31 ±2.54) U/ml,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 人胰腺癌MUC1 mRNA体外转染DC后可诱导CTL产生特异性抗肿瘤免疫反应.     

胰腺癌相关抗原MUC1与survivin mRNA联合转染树突细胞激发特异性细胞毒T淋巴细胞能力的体外研究

目的 研究人胰腺癌MUC1与survivin mRNA联合转染树突细胞（DC）体外激发特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）的能力,为构建负载多抗原表位DC疫苗治疗胰腺癌提供实验依据.方法 自6例胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养并鉴定DC.常规培养人胰腺癌细胞株MiaPaCa-2,采用RT-PCR方法扩增MUC1和survivin mRNA.应用电穿孔法将两种mRNA单独或联合转染DC,分别命名为DC-MUC1、DC-survivin、DC-MUC1＋ survivin.采用实时定量PCR法检测DC的MUC1、survivin mRNA表达;四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测DC存活率;使用混合细胞培养法检测转染DC体外刺激自体T淋巴细胞的增殖能力;应用ELISA法检测转染DC体外激发抗原特异性CTL释放Th1型细胞因子IL-2、IL-10、granzyme B、IFN-γ的水平.结果 成功获得成熟的DC,成熟DC的表面标志物CD40、HLA-DR、CD83和CD86的阳性表达率分别为34.31％、50.21％、89.17％和73.62％.DC-MUC1的MUC1 mRNA表达量为36.24±5.17;DC-survivin的survivin mRNA表达量为34.53±4.02;DC-MUC1＋survivin的MUC1、survivin mRNA表达量分别为31.79±4.26和14.67±2.96,显著低于单转染的DC（P值均＜0.05）.DC-MUC1＋ survivin的存活率呈现时间依赖性下降,96 h时的存活率显著低于单转染DC（50.21％比80％左右,P值均＜0.05）.当作为刺激细胞的DC和作为效应细胞的T淋巴细胞比例为1∶10、1∶20时,DC-MUC1＋ survivin刺激自体T细胞的增殖指数显著高于单转染DC,差异有统计学意义（P值均＜0.05）;而比例为1∶40、1∶80时的增殖指数差异无统计学意义.当DC∶T为1∶10孵育14 d时,DC-MUC1、DC-survivin、DC-MUC1＋survivin的IL-2水平分别为（892.73±32.90）、（713.62±56.37）、（1884.37±95.21） pg/ml;granzyme B水平分别为（501.62±12.30）、（203.84±12.55）、（1193.15±86.04） pg/ml;IFN-γ水平分别为（981.50±47.82）、（696.05±41.66）、（2237.94±189.55） pg/ml.DC-MUC1＋ survivin显著高于单转染的DC,差异有统计学?     

HBsAg基因修饰的树突状细胞诱导HBV转基因小鼠的免疫应答

目的探讨HBsAg重组腺病毒Ad—S转染的小鼠树突状细胞（DC）诱导HBV转基因（Tg）小鼠免疫应答的作用特点及其可能的治疗作用。方法Tg小鼠的骨髓细胞体外扩增为DC，转染Ad—S或被HBsAg蛋白冲击后，与pcDNA3．1（＋）-S质粒分别免疫Tg鼠，用流式细胞术、乳酸脱氢酶释放法、酶联免疫分析（ELISA），荧光定量聚合酶链反应（PCR）等分别检测脾脏T细胞内细胞因子和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性、血清HBsAg，抗-HBs、HBVDNA及丙氨酸转氨酶（ALT）水平；病理和免疫组化分析肝脏组织学及HBsAg和HBcAg表达。结果免疫后1～2周，DC／Ad-S比DC／HBsAg和pcDNA3．1（＋）-S诱导rrc分泌干扰素7（IFN-g）和特异性CTL均显著增强，而DC／HBsAg组CTL较pcDNA3．1（＋）-S组增强（P〈0．05）；DC／HBsAg免疫后1、2、4周CTL迅速减弱，DC／Ad-S在1、2周CTL差异不明显，但至4周时明显减弱。免疫后1～4周，对Tg鼠血清HBsAg、HBVDNA及肝组织HBcAg和HBsAg表达的抑制作用最强为DC／Ad-S免疫，其次为DC／HBsAg，显著强于pcDNA3．1（＋）-S（P〈0．05或P〈0．01）。肝脏组织学、血清抗-HBs和ALT水平各组差异无统计学意义。结论Ad—S转染的DC比HBsAg冲击的DC和DNA疫苗诱导更强的Tcl和CTL应答，能较迅速抑制HBV转基因小鼠血清HBsAg、HBVDNA和肝脏HBcAg和HBsAg表达。     

树突状细胞诱导的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞对裸鼠人肝癌转移的预防和治疗

目的探讨肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对裸鼠人肝癌转移模型LCI-D20的治疗作用。方法从健康人外周血单个核细胞中诱导树突状细胞,用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4刺激活化,经人肝癌细胞株MHCC97-H肿瘤抗原致敏后,诱导肿瘤抗原特异性CTL,经腹腔注射,以自然杀伤样T淋巴细胞(CIK)和磷酸盐缓冲液为对照,研究其对LCI-D20肝癌治疗和预防转移作用。结果肿瘤抗原特异性CTL组、CIK 组和对照组肝癌肿块重量、血清甲胎蛋白含量、肝癌肝内转移率和存活期依次为(1．11±0．63)g、(1．12±0．36)g 和(2．68±0．53)g;(52．1±9．7)μg／L、(48．6±5．2)μg／L和(82．2±7．2)μg/L;16．7％、16．7％和58．3％; (79．0±5．0)d、(73．3±7．0)d和(52．3±5．2)d。对照组与前两组比较差异均有统计学意义(P值均<0．01)。结论肿瘤抗原特异性CTL可以预防LCI-D20模型肝癌发生转移,延长动物存活时间。     

慢性乙型肝炎患者树突状细胞诱导的HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞PD-1的表达

目的 探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者树突状细胞(DC)诱导的HBV特异性细胞毒性T细胞(CTL)表面程序性死亡受体1(PD-1)的表达情况及其与HBV DNA的关系.方法 采集30例CHB患者和10例健康人的抗凝外周静脉血,分离外周血单个核细胞(PBMC),在白细胞介素(IL)-4和粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的作用下培养使DC增殖、成熟,培养第4d加入纯化的HBsAg进行冲击.采同一患者外周血,分离出自体T淋巴细胞,用含重组人白细胞介素(rhIL)-2的培养基维持T细胞的生长,培养第5d与HBsAg冲击的DC共培养.以流式细胞技术检测CTL的PD-1表达,并分析PD-1表达水平与HBV DNA的关系.结果 与健康对照组比较,CHB组DC诱导的HBV特异CTL的PD-1的表达明显升高(P=0.000).且HBeAg阳性组PD-1的表达率较HBeAg阴性组明显升高(P=0.000).CHB患者DC诱导的HBV特异性CTL的PD-1表达率与血清HBV DNA拷贝数的对数值呈正相关(r=0.53,P=0.008).结论 CHB患者DC诱导的HBV特异性CTL高表达PD-1分子,为HBV慢性感染过程中CTL功能低下,病毒难以清除提供了另一条重要线索.     

经沉默免疫负调控基因技术处理的树突状细胞联同细胞毒性T淋巴细胞对HepG2细胞移植瘤的抑制作用

目的观察经沉默免疫负调控基因(iAPA)技术处理的树突状细胞(DC)联同细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(iAPA-DC/CTL)对HepG2细胞移植瘤的抑制作用。方法利用人肝癌细胞系HepG2建立裸鼠皮下移植瘤模型,将12只裸鼠随机分为2组:生理盐水对照组(C组)和iAPA-DC/CTL组(DC组),每组6只,行iAPA-DC/CTL治疗4次(1周/次)后处死。实验期间观察各组裸鼠的肿瘤生长,测量肿瘤长短径并描绘肿瘤生长曲线,称量瘤重并计算抑瘤率,病理检测。两组间均数比较采用成组t检验。结果造模成功率为92.31%。C组和DC组肿瘤体积分别为:(697.69±143.99)、(485.64±188.75)mm3,DC组生长相对缓慢(t=2.28,P0.05);C组和DC组肿瘤重量分别为:(0.32±0.07)、(0.22±0.08)g,DC组肿瘤重量小于对照组(t=2.31,P0.05),抑瘤率为30.39%。肿瘤免疫组化染色后T淋巴细胞计数分别为:C组未见、DC组(39.74±5.11)个/高倍视野,DC组肿瘤内T细胞数多于对照组(t=19.05,P0.05)。结论 iAPA-DC/CTL能够有效抑制HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤的生长。     

白血病抗原冲击致敏的树突状细胞诱导的抗肿瘤免疫反应

目的：研究树突状细胞(DC)的体外培养扩增及诱导特异性的抗肿瘤免疫反应。方法：使用mGM-CSF加mIL-4培养诱导骨髓细胞分化，采用反复冻融法制备L7212白血病细胞的冻融抗原(TAA)，在DC培养的第3天加入TAA，将TAA冲击致敏的DC与T淋巴细胞共培养，获得肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，采用MTT法检测CTL对L7212细胞的杀伤作用及其对野生型L7212细胞再攻击的免疫保护作用。结果：MTT检测发现CTL对L7212细胞有特异性杀伤抑制作用，L7212抗原冲击致敏的DC能显著提高和延长野生型L7212细胞再攻击小鼠的生存率和存活期。结论：mGM-CSF和mIL-4配伍可有效地从小鼠骨髓细胞中诱导出大量的成熟的功能性DC，L7212白血病TAA冲击致敏的DC可诱导机体产生较强的抗肿瘤免疫反应。     

HBsAg、HBcAg活化树突状细胞治疗慢性乙型肝炎的体外研究

目的 研究慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞(DC)经HBsAg、HBcAg活化后的免疫功能.方法 从慢性乙型肝炎患者外周血中培养扩增DC,在DC成熟前,加入纯的HBsAg、HBcAg刺激,用流式细胞仪检测DC表型,用液闪计数仪观察DC对T细胞的增殖作用,用ELISA法检测混合淋巴细胞反应(MLR)中细胞因子的分泌水平.结果 经HBcAg刺激DC的CD86表达率为(92.14±5.12)%,明显高于HBsAg刺激组和未加抗原组(P＜0.01);经HBcAg刺激组DC诱导同种异体静止T细胞增殖的能力每分钟液闪计数值(cpm)为34259±3127,明显高于HBsAg刺激组(20258±2917)和单个核细胞组(3469±417),P＜0.01;经HBcAg刺激组DC MLR中IL-12浓度为(342±42.3)ng/L,分别高于HBsAg刺激组和未加抗原组(P＜0.01).结论 体外经HBcAg刺激DC可有效提呈抗原病毒,并可进一步刺激T细胞产生.     

Induction of antitumour immunity using survivin peptide-pulsed dendritic cells in a murine lymphoma model

Survivin is overexpressed in several types of haematological malignancies making it an attractive target for therapeutic cytotoxic T-lymphocyte responses. Here, we identify two peptide epitopes derived from the murine survivin protein and demonstrate that Balb/c mice treated with syngeneic dendritic cells pulsed with the survivin epitopes were able to reject an otherwise lethal tumour inoculation of the A20 lymphoma. For the first time, these data provide evidence for the use of survivin peptide epitopes in T cell-based immunotherapeutic concepts against a B-cell lymphoma in vivo.     

胃腺癌BGC-823细胞总RNA转染人树突状细胞分泌exosomes的抗肿瘤效应研究

目的研究人外周血树突状细胞（DC）体外经人胃腺癌BGC-823细胞系总RNA转染后,提取培养上清液中DC分泌的外泌体（exosomes）,诱导出特异性抗胃癌效应。方法分离外周血单核细胞,经GM-CSF、IL-4培养5d后,获得未成熟DC（imDC）;体外以脂质体转染BGC-823细胞总RNA。第7天收集上清,利用超速离心法提取exosomes。分别将DC以及exosomes与T淋巴细胞共培养3d,获得细胞毒T淋巴细胞（CTL）,检测CTL对BGC-823细胞的杀伤作用。结果与未转染组相比,转染BGC-823总RNADC来源的exosomes明显促进T细胞对BGC-823的杀伤活性（P〈0．05）。结论应用BGC-823总RNA转染DC分泌exosomes能够诱导出强烈的抗肿瘤免疫反应。     

树突细胞与NCI-H460肺癌细胞融合体诱导抗肿瘤作用的实验研究

目的研究树突细胞(DC)与NC I-H460细胞融合体诱导的抗肿瘤作用。方法(1)从人外周血单核细胞诱导DC并与NC I-H460细胞融合。设融合细胞(FC)组、冲击细胞(PC)组及T细胞(TC)组,分别以融合细胞活化的T细胞、抗原冲击DC活化的T细胞及未活化T细胞为效应细胞,用乳酸脱氢酶法测定3种效应细胞对NC I-H460细胞的杀伤作用。(2)皮下注射NC I-H460细胞制备荷瘤裸鼠,将18只荷瘤裸鼠随机分为FC组、PC组及TC组,每组6只,接种上述3种T细胞,比较3组裸鼠肿瘤体积和重量。结果(1)对NC I-H460细胞的杀伤率,FC组为43.54%,PC组26.57%,TC组3.25%,3组杀伤作用比较,差异有统计学意义(F=5.47,P<0.05)。(2)FC组肿瘤体积明显小于PC组和TC组。FC组肿瘤重量为(1 129±123)mg,PC组为(1 709±160)mg,TC组为(3 344±288)mg,3组差异有统计学意义(F=37.05,P<0.01)。结论DC与NC I-H460细胞融合体可有效诱导抗肿瘤免疫,作用优于细胞抗原冲击的DC。     

Preventive antitumor activity against hepatocellular carcinoma (HCC) induced by immunization with fusions of dendritic cells and HCC cells in mice

BACKGROUND: The prevention of recurrence of hepatocellular carcinoma (HCC) after treatment is very important for improvement of the prognosis of HCC patients. Dendritic cells (DCs) are potent antigen-presenting cells that can prime naive T cells to induce a primary immune response. We attempted to induce preventive antitumor immunity against HCC by immunizing BALB/c mice with fusions of DCs and HCC cells. METHODS: Murine bone marrow-derived DCs and a murine HCC cell line. BNL cells, were fused by treatment with 50% polyethyleneglvcol (PEG). Fusion efficacy was assessed by the analysis of fusions of BNL cells stained with red fluorescent dye and DCs stained with green fluorescent dye. Mice injected intravenously with DC/BNL fusions were challenged by BNL cell inoculation. RESULTS: About 30% of the PEG-treated non-adherent cells with both fluorescences were considered to be fusion cells. The cell fraction of DC/BNL fusions showed phenotypes of DCs, MHC class II, CD80, CD86, and intercellular adhesion molecule (ICAM)-1, which were not expressed on BNL cells. Mice immunized with the fusions were protected against the inoculation of BNL tumor cells, whereas injection with a mixture of DCs and BNL cells not treated with PEG did not provide significant resistance against BNL cell inoculation. Splenocytes from DC/BNL fusion-immunized mice showed lytic activity against BNL cells. CONCLUSIONS: These results demonstrate that immunization with fusions of DCs and HCC cells is capable of inducing preventive antitumor immunity against HCC.     

树突状细胞诱导的抗肿瘤免疫诱导移植瘤细胞凋亡并抑制其增殖

目的研究树突状细胞(DC)体外诱导的细胞免疫能否抑制裸鼠移植瘤生长及其机制.方法联合应用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白介素-4(IL-4)直接从肝癌患者外周血中培养出DC,以源于人肝癌细胞系HepG2肿瘤细胞的肿瘤抗原粗提物刺激DC,DC激活同源的T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL),建立裸鼠人肝癌细胞系HepG2移植瘤模型.以CTL治疗裸鼠HepG2移植瘤并观察治疗效果,检测移植瘤标本肿瘤细胞凋亡情况.结果DC诱导的CTL通过诱导肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖而抑制移植瘤生长.结论经肿瘤抗原激发的DC有可能在肿瘤的治疗中发挥重要作用.