Construction of Shuttle Expression Plasmid and Stable Expression of Foreign Gene in Mycobacteria and E．Coli

ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＳｈｕｔｔｌｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｌａｓｍｉｄａｎｄＳｔａｂｌｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ　ＦｏｒｅｉｇｎＧｅｎｅｉｎＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａａｎｄＥ．ＣｏｌｉＨＵＡＮＧＦＵＹｏｎｇ－ｍｕ（皇甫永修）；ＺＨＡＮＧＤａ－ｊｕ...     

硒多糖、亚硒酸钠对大鼠肝线粒体酶的影响及其拮抗亚砷酸钠毒性作用的机理

采用体内、体外实验方法研究了硒化合物（硒多糖、亚硒酸钠）和亚砷酸钠对大鼠肝线粒体丙酮酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性以及对肝线粒体膜脂质过氧化、还原型谷胱甘肽含量的影响，探讨了其作用机理。结果表明：硒化合物可明显拮抗亚砷酸钠对线粒体丙酮酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用，且硒多糖的抑制作用较亚硒酸钠强。这种拮抗作用在防治砷中毒方面具有重要意义。     

人结核杆菌热休克蛋白70启动子对外源基因在分枝…

利用聚合酶链反应技术（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）扩增得到１５０ｂｐ的人结核杆菌热休克蛋白（Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＳＰ）７０启动子和约６５０ｂｐ的外源基因日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶（ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＧＳＴ）的ｃＤＮＡ片段，并采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测定了人结核杆菌ＨＳＰ７０起始密码ＡＴＧ上游１５０ｂｐ的启动子序列，在     

百日咳杆菌毒素S_1亚单位与谷胱甘肽S-转移酶融合基因在大肠杆菌中表达及其一步纯化

研究了百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位与谷胱甘肽Ｓ－转移酶融合蛋白（ＧＳＴ－Ｓ１）在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达,并一步纯化了重组ＧＳＴ－Ｓ１。首先用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出长度为５６０ｂｐ的编码百日咳毒素Ｓ１亚单位的ＤＮＡ片段。该片段比原编码Ｓ１蛋白的ＤＮＡ片段在其３′端缺失了１３８个碱基,将其按正确的阅读框克隆入质粒ｐＧＥＸ中ＧＳＴ基因的３′端,构成ＧＳＴ－Ｓ１融合基因表达载体ｐＧＥＸ－Ｓ１。经异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达和十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）,可见所表达的ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白存在于细菌上清,为可溶性蛋白。分子量为４９ｋｕ处有明显的蛋白表达带。用谷胱甘肽（ＧＳＨ）亲和层析系统,一步纯化出ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白。最后经凝血酶的消化,得到２３ｋｕ的重组百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位蛋白。为百日咳疫苗的发展提供了依据     

百日咳杆菌毒素S1亚单位在E.coli中的表达及其一步纯化

百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位在Ｅ．ｃｏｌｉ中的表达及其一步纯化程继忠皇甫永穆海涛郑波白百破（ＤＴＰ）疫苗组成成分之一为百日咳杆菌，其成分复杂，全菌体疫苗接种后副作用大。为解决此问题，近年从中发现导致百日咳免疫的主要成分之一为百日咳毒素的Ｓ１亚单位，故选用...     

人结核杆菌热休克蛋白70和卡介苗α抗原基因启动子序列测定

用Ｔ７ＤＮＡ聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白７０（ｈｓｐ７０）基因的启动子序列和卡介苗（ＢＣＧ）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的ｈｓｐ７０启动子序列为人结核杆菌ｈｓｐ７０编码基因起始密码（ＡＴＧ）上游１５０个脱氧核苷酸，其中在ＡＴＧ上游－１２￣－８核苷酸处有核糖体结合位点（ＳＤ序列）ＧＧＡＧＧ，在ＲＮＡ聚合酶的结合     

血吸虫Sj26膜锚定表达DNA疫苗的构建、表达及其免疫原性

目的构建含日本血吸虫相对分子质量为26000的抗原（Sj26GST）基因的膜锚定表达DNA疫苗，观察其免疫BALB／c小鼠后的免疫应答效应。方法用RT—PCR法，以血吸虫成虫RNA为模板，扩增获得Sj26的全长基因。利用重组PCR技术，在Sj26基因的5’端加上编码IL-2的信号肽核苷酸序列，3’端加上编码胎盘碱性磷酸酶的膜锚定序列，然后将其克隆入pIRES载体中，构建一个膜锚定型真核表达质粒pIRES-Sj26。将重组质粒转染HeLa细胞，通过RT—PCR及间接免疫荧光技术检测目的基因的表达。用构建的pIRES-Sj26疫苗肌肉注射免疫BALB／c小鼠后，以ELISA试剂盒检测小鼠血清中的总IgG抗体浓度，脾细胞培养法检测脾淋巴细胞培养上清的干扰素γ（INF-γ）含量，淋巴细胞刺激指数（SI）反映淋巴细胞增殖能力，流式细胞术检测脾细胞CD4／CD8亚群。结果经过酶切鉴定、PCR及测序证实重组质粒pIRES-Sj26构建成功，经转染HeLa细胞及免疫荧光检测证明质粒pIRES-Sj26能在体外进行表达。免疫小鼠后检测结果表明pIRES-Sj26组的血清总IgG抗体浓度、INF-γ的含量明显高于空白对照组和空载体组（均P〈0．01）；其脾SI高于空白对照组和空载体组（P〈0．05）；CD8^＋细胞百分比高于空白对照组和空载体组（均P％0．05），CD4^＋细胞百分比没有显著变化（P〉0．05）。结论成功构建日本血吸虫膜锚定表达DNA疫苗pIRES-Sj26，表达的Sj26蛋白大部分锚定在细胞膜上。pIRES—Sj26疫苗能增强BALB／c小鼠的免疫应答反应。     

日本血吸虫26ku抗原基因在分枝杆菌和大肠杆菌中的高效表达

构建了大肠杆菌－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００，并将日本血吸虫２６ｋｕ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）基因在分枝杆菌中进行了克隆和表达。以质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｓｋ为骨架，分别克卫生玫分枝杆菌质粒复制基因、Ｎｅｏ基因（编码卡那霉素抗性）以及人结核杆菌热休克蛋白７０（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｈｓｐ７０）的启动子，并带有质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ的多克隆位点，构建成分枝杆菌－大肠杆菌穿梭     

卡介苗基因组的克隆

以质粒pUC19为载体克隆了卡介苗(即卡介菌,BCG)DNA.Sau3Al部分酶解BCG DNA,通过琼脂糖电泳分离2～9Kb DNA片段.BamHl酶切质粒pUC19,碱性磷酸酶去磷酸化.2～9kb DNA片段与pUC19载体用T4连接酶连接转化大肠杆菌HB101,在含氨苄青霉素(Amp)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的LB平板上获得抗Amp白色转化子.随机挑选12个转化子快速提取重组子、电泳检查结果:其中8个分子量扩大.选择5个分子量扩大重组子经BamHl酶切,电泳分析表明DNA插入片段约在2～7kb之间.