基于TCPA数据库的结直肠癌预后相关蛋白预后模型的建立与应用

目的 利用TCPA数据库建立预测结直肠癌预后的蛋白预后模型,分析蛋白预后模型与结直肠癌各临床病理特征之间的关系.方法 通过R语言软件筛选出TCPA数据库中结直肠癌样本及正常样本中差异表达的蛋白质,进一步利用COX比例风险回归模型筛选和建立多蛋白预后模型,计算预后评分.根据预后评分的中位数将患者分为高风险组和低风险组,利用Kaplan-Meier生存曲线分析高风险组及低风险组生存差异.将临床病理因素和预后评分因素纳入COX回归模型分析结直肠癌患者的生存影响因素.根据临床病理因素与结直肠癌相关蛋白预后模型预后评分的相关性,验证多蛋白模型对结直肠癌患者中的预后价值.结果 共筛选出7个差异蛋白(BIM,SRC,BID,CYCLIND,SRC_pY527,IGFBP2,INPP4B)建立结直肠癌相关蛋白预后模型.Kaplan-Meier生存分析证实,在结直肠癌患者中,预后评分低风险的患者总体生存率明显升高,差异有统计学意义(P<0.001).COX回归分析显示,结直肠癌预后相关蛋白预后模型是结直肠癌患者预后的独立影响因素(P<0.01).结论 结直肠癌预后相关蛋白预后模型可用于预测结直肠癌患者的预后,有利于进一步指导临床治疗.     

结直肠癌中LC3与CD4~+、CD8~+、CD68~+免疫细胞浸润的相关性及其临床意义

目的观察自噬标志物LC3与肿瘤表面抗原NY-ESO-2、MAGE-D4在结直肠癌及癌旁正常黏膜组织中的表达以及CD4~+、CD8~+、CD68~+免疫细胞的浸润情况,分析LC3与NY-ESO-2、MAGE-D4以及CD4~+、CD8~+、CD68~+免疫细胞浸润的相关性,探讨结直肠癌细胞自噬对免疫细胞的影响及其临床意义。方法应用免疫组化En Vision法、Western blot法检测128例结直肠癌及癌旁正常黏膜组织中LC3、NY-ESO-2、MAGE-D4的表达以及CD4~+、CD8~+、CD68~+免疫细胞浸润情况,探讨各因子之间的相关性并结合临床病理特征进行分析。结果 (1)LC3在结直肠癌组织中的表达高于癌旁正常黏膜组织,NY-ESO-2在结直肠癌中低表达,MAGE-D4在结直肠癌中高表达,两者在癌旁正常黏膜组织中几乎不表达(P0.05);CD4~+、CD8~+、CD68~+免疫细胞在结直肠癌中的浸润量均高于癌旁正常黏膜组(P0.05);(2)结直肠癌中LC3与肿瘤表面抗原NY-ESO-2、MAGED4的表达以及CD4~+、CD8~+、CD68~+细胞的浸润量均呈正相关(P0.05);(3)NY-ESO-2的表达与CD4~+、CD8~+、CD68~+细胞的浸润量均呈正相关,MAGE-D4的表达与CD8~+、CD68~+细胞的浸润量均呈正相关(P0.05);(4)LC3、NY-ESO-2、MAGE-D4的表达及CD4~+、CD8~+免疫细胞的浸润量均与淋巴结转移呈负相关(P0.05);LC3、NY-ESO-2、MAGE-D4的表达及CD4~+、CD8~+、CD68~+细胞的浸润量与TNM分期呈负相关(P0.05);LC3的表达与结直肠癌的分化程度呈正相关;CD8~+细胞的浸润量与组织学分级呈正相关(P0.05)。结论结直肠癌中自噬标志物LC3的表达与肿瘤表面抗原NY-ESO-2、MAGE-D4的表达、免疫细胞CD4~+、CD8~+、CD68~+的浸润量具有相关性,自噬活性改变可能影响结直肠癌的细胞免疫。     

自噬相关蛋白LC3与Raptor、Rictor在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义

目的 观察自噬相关蛋白LC3、Raptor、Rictor在甲状腺乳头状癌中表达情况,分析其与临床病理因素之间的关系。方法 采用免疫组织化学法检测LC3、Raptor、Rictor在甲状腺乳头状癌及其癌旁组织中的表达情况,并结合临床病理因素进行分析。结果 LC3、Raptor、Rictor在甲状腺乳头状癌中的阳性表达率分别为76.7、82.5、41.7%,在癌旁组织中的阳性表达率分别为4.9、16.5、7.8%,三项指标的表达差异均有统计学意义。LC3的表达与肿瘤长径及砂砾体形成相关,Raptor、Rictor的表达均与TNM分期相关,Rictor的表达与淋巴结转移相关。结论 LC3、Raptor、Rictor在甲状腺乳头状癌中表达升高,对于甲状腺乳头状癌的诊断、判断预后方面具有潜在价值。     

干预自噬影响DPD的表达促进5-FU抗结直肠癌疗效的实验研究

背景与目的：结直肠癌作为常见的消化系统恶性肿瘤之一,其化疗与耐药一直以来备受关注,5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）是结直肠癌的一线化疗药物,其疗效常因耐药或不良反应而受到影响。二氢嘧啶脱氢酶（dihydropyrimidine dehydrogenase,DPD）是5-FU代谢的关键限速酶,其表达或降解可能成为影响5-FU疗效的因素。自噬是细胞内蛋白质代谢的重要途径,其在化疗诱导的细胞死亡或增殖抑制中的作用仍存在争议。本研究旨在探讨自噬在结直肠癌化疗过程中的作用以及干预自噬影响5-FU耐药的机制。方法：体外细胞培养人结肠癌HCT-8、COLO205、LOVO和SW480细胞系,观察不同细胞系中DPD的表达对5-FU敏感性的影响,通过药物敏感性实验筛选出5-FU敏感细胞,检测5-FU敏感细胞株及其相对应的耐药细胞株中DPD的表达、自噬水平及自噬关键因子微管相关蛋白轻链3（light chain 3,LC3）、P62的表达,并通过诱导/抑制细胞自噬,观察调控自噬状态对DPD的表达变化以及肿瘤细胞生物学行为和化疗抵抗能力的影响,通过UbiBrowser数据库筛选及免疫共沉淀实验（co-inmunoprecipitation,Co-IP）实验验证DPD降解过程中的E3连接酶,探讨自噬降解DPD逆转5-FU耐药的分子机制。结果：DPD低表达的细胞系对5-FU的敏感性更强,其中COLO205细胞系在4种细胞中DPD表达量最高,并对5-FU的耐药性最强,而HCT-8细胞DPD表达最低并对5-FU最为敏感。与HCT-8细胞相比,HCT-8/FU耐药细胞表达较高水平的DPD,以及较低的基础自噬水平;雷帕霉素（rapamycin,RAPA）介导的自噬激活增强了细胞的自噬水平,降低了DPD表达,同时降低了细胞增殖、侵袭和5-FU耐药性;3甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）及羟氯喹（hydroxychloroquine,HCQ）介导的自噬抑制减弱了细胞的自噬水平,增加了DPD表达,增强了5-FU耐药性。5-FU与自噬激活剂联合应用对细胞的抑效果要远远强于单用5-FU及与自噬抑制剂联合应用的效果;DPD的降解需要完整的自噬流的参与,其中自噬溶酶体的形成是DPD降解的关键步骤之一,而单一的自噬体无法对DPD进行降解。E3连接酶NEDD4在HCT-8/5-FU细胞中与DPD和P62蛋白免疫共沉淀,在DPD的自噬降解中发挥作用。结论：自噬参与DPD降解影响结直肠癌细胞对化疗药物的敏感性,激活自噬可促进DPD降解和抑制5-FU的分解代谢,可能成为逆转结直肠癌5-FU耐药的新途径。     

结直肠癌中DPD与LC3、P62表达的相关性及其临床意义

背景与目的：结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一,应用5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）治疗结直肠癌常因耐药或不良反应影响其疗效,二氢嘧啶脱氢酶（dihydropyrimidine dehydrogenase,DPD）是5-FU代谢的关键酶,其表达量或降解率可能成为影响5-FU疗效的因素,自噬是细胞内蛋白质降解的重要途径。检测结直肠癌中自噬关键因子微管相关蛋白轻链3（light chain 3,LC3）、P62和DPD的表达,探讨其相关性及临床意义,为逆转5-FU耐药提供新思路。方法：采用免疫组织化学EnVision法检测2013—2014年滨州医学院附属医院病理科存档的157例结直肠癌石蜡包埋组织,采用蛋白质印迹法（Western blot）及实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）检测2020年滨州医学院附属医院病理科接收的44例结直肠癌新鲜组织中LC3、P62和DPD的表达,分析其相关性及其临床意义。结果：结直肠癌组织中LC3、P62和DPD的mRNA及蛋白表达量均高于正常黏膜组织（P<0.05）。P62与DPD的表达呈正相关,LC3与P62、DPD的表达均呈负相关（P<0.05）。P62^–/LC3^–组中DPD蛋白表达量明显高于其他3组,而P62^–/LC3⁺组中DPD蛋白表达量则低于其他3组（P<0.05）。P62⁺/LC3^–组与P62⁺/LC3⁺组中DPD蛋白表达量虽不同,但差异无统计学意义（P>0.05）。结直肠癌中P62蛋白表达与T分期及淋巴结转移呈正相关;LC3蛋白表达与肿瘤直径及T分期呈正相关;DPD蛋白表达则与组织学类型密切相关（P<0.05）。LC3、P62、DPD及淋巴结转移与结直肠癌患者预后密切相关,四者均是结直肠癌患者预后的独立危险因素。结论：LC3和P62可影响DPD的表达,自噬-溶酶体途径可能是DPD降解的重要途径,其有可能通过DPD降解进而影响结直肠癌对5-FU的耐药。     

结直肠癌中LC3与不同表型肿瘤相关巨噬细胞的相关性及其临床意义

背景与目的：肿瘤免疫逃逸成为免疫治疗的难点，而结直肠癌中过度自噬可引起肿瘤微环境内抗原物质的增加，进而诱导抗肿瘤免疫。通过检测自噬相关因子LC3、不同表型肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）及其分泌产物在结直肠癌中的表达，探讨其相关性及临床意义。方法：采用免疫组织化学EnVision法检测滨州医学院附属医院病理科及滨州市第二人民医院病理科2013年1月—2014年12月存档的结直肠癌样本中LC3、CD16、CD163、IL-1、IL-10、TNF-α、TGF-β的表达，计数CD4 ⁺ 、CD8 ⁺ 、CD20 ⁺ 淋巴细胞及CD68 ⁺ 、CD16 ⁺ 、CD163 ⁺ 巨噬细胞，并分析其与临床病理学特征及预后的相关性。结果：自噬相关因子LC3、CD16、CD163在结直肠癌组织中的表达均高于癌旁正常黏膜组织（P<0.05）。LC3与M1型TAM及其在巨噬细胞中的占比均呈正相关，而与M2型TAM及其在巨噬细胞中的占比均呈负相关（P<0.05）。LC3、M1型TAM与IL-1、TNF-α的表达及CD4 ⁺ 、CD8 ⁺ 、CD20 ⁺ 淋巴细胞的浸润量呈正相关；而M2型TAM与IL-10、TGF-β的表达呈正相关，而与CD4 ⁺ 、CD8 ⁺ 、CD20 ⁺ 淋巴细胞的浸润量呈负相关（P<0.05）。LC3、CD16、CD163与肿瘤直径、浸润深度及淋巴结转移密切相关（P<0.05）。Kaplan-Meier及COX回归模型分析显示，LC3、CD16、CD163及淋巴结转移与结直肠癌患者预后密切相关，是结直肠癌预后的独立危险因素。结论：结直肠癌中LC3的表达增加与M1型TAM极化、肿瘤进展密切相关，提示患者预后不良。结直肠癌中自噬水平的增高可诱导巨噬细胞募集并向M1型TAM极化，进而诱导免疫细胞聚集，因此调控自噬可成为诱导结直肠癌中TAM极化、增强抗肿瘤免疫的新思路。     

结直肠癌中PHLPP2、PTEN与p-Akt1表达的相关性及其临床意义

目的检测PHLPP2、PTEN与p-Akt1及其下游分子VEGF、BCL-2及Cyclin D1在结直肠癌中的表达,探讨蛋白表达的相关性及其临床意义。方法采用免疫组化En Vision法和RT-PCR法检测结直肠癌及正常结直肠黏膜组织中PHLPP2、PTEN、p-Akt1、VEGF、BCL-2及Cyclin D1的表达,并分析蛋白表达与临床病理特征及预后的相关性。结果结直肠癌组织中PHLPP2和PTEN阳性率低于正常结直肠黏膜组织;p-Akt1、VEGF、BCL-2及Cyclin D1在结直肠癌组织中的阳性率明显高于正常结直肠黏膜组织(P0.05)。结直肠癌中PHLPP2与p-Akt1、VEGF、BCL-2、Cyclin D1表达均呈负相关(P0.05)。PHLPP2、PTEN均阳性的结直肠癌组织中p-Akt1阳性率明显低于其他组;PHLPP2、PTEN均阴性结直肠癌组中p-Akt1阳性率明显高于其他分组(P0.05)。PHLPP2、PTEN蛋白表达水平与分化程度及淋巴结转移具有相关性;p-Akt1蛋白表达水平与分化程度、浸润深度和淋巴结转移密切相关(P0.05)。Kaplan-Meier分析显示,PHLPP2、PTEN、p-Akt1与结直肠癌患者预后相关。Cox回归模型分析显示,PHLPP2、PTEN、p-Akt1、分化程度及淋巴结转移是结直肠癌预后的独立危险因素。结论 PHLPP2与PTEN做为抑癌基因共同影响Akt1磷酸化,PHLPP2在结直肠癌中表达缺失与肿瘤的发生、发展及转移密切相关,可作为评估结直肠癌患者预后的潜在分子标志物。     

大肠癌组织中PIK3CA、PIK3CB蛋白与多药耐药基因产物表达的相关性及其临床意义

目的:检测PIK3CA、PIK3CB和多药耐药基因1(muhidrug resistance 1,MDR-1)、肺耐药蛋白(lung cancer resistance protein,LRP)、谷胱甘肽转移酶π(glutathione-S-transferaseπ,GST-π)、D N A拓扑异构酶Ⅱ(DNA topoisomeraseⅡ,TopoⅡ)在大肠癌中的表达,探讨PIK3CA、PIK3CB对大肠癌多药耐药性的影响.方法:应用免疫组织化学EnVision法检测316例大肠癌组织中PIK3CA、PIK3CB、MDR-1、LRP、GST-π和TopoⅡ的表达情况,并结合临床病理因素进行分析.结果:316例大肠癌中,PIK3CA、PIK3CB的表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移成正相关,其相关系数分别为0.136、0.168.MDR基因在大肠癌组织中的阳性率分别为:M D R-1为72.78%(230/316)、L R P为70.89%(224/316)、TOPⅡ为77.53%(245/316)及GST-π为76.58%(242/316).经Spearman相关性分析,PIK3CA、PIK3CB的表达与多药耐药蛋白MDR-1、LRP、GST-π的表达均成正相关,相关系数分别为0.288、0.128、0.1 9 7.3 1 6例大肠癌患者的中位生存期为60 mo,5年生存率为47.5%,Kaplan-Meier分析结果显示,PIK3CA与PIK3CB同时高表达、淋巴结转移、MDR-1(+)、GST-π(+)患者术后5年生存率明显降低.Cox比例风险模型显示,PIK3CA(+)PIK3CB(+)、淋巴结转移、MDR-1、GST-π是影响大肠癌患者预后的独立因素.结论:PIK3CA、PIK3CB与大肠癌的多药耐药密切相关,PIK3CA、PIK3CB、淋巴结转移、MDR-1、GST-π是影响大肠癌患者预后的独立因素,检测PIK3CA、PIK3CB为临床合理选择化疗药物、初步判断预后具有重要参考价值.     

大肠癌中Beclin1、LC3和mTOR的表达及意义

目的：探讨Beclin1、LC3和mTOR在大肠癌中的表达及意义。方法采用免疫组化EnVision法、Western blot和RT-PCR技术检测Beclin1、LC3和mTOR在大肠癌中的表达,并结合临床病理因素进行分析。结果 Beclin1、LC3和mTOR在大肠癌中的阳性率分别为90．50%、87．19%和46．28%,均明显高于癌旁组织( P<0．05),且LC3蛋白在中+低分化大肠癌中的表达(91．34%、89．58%)高于高分化大肠癌(77．61%),在有淋巴结转移组的表达(95．41%)高于无淋巴结转移组(80．45%), mTOR在有淋巴结转移组的表达(57．80%)高于无淋巴结转移组(35．33%)(P<0．05),Beclin1过表达与大肠癌分化程度和淋巴结转移均无关(P>0．05)。 LC3与Beclin1在大肠癌中表达呈正相关(rs =0．593,P<0．01),与mTOR表达呈负相关(rs =-0．165,P<0．01),Beclin1和mTOR表达之间无明显相关性(P>0．05)。 Kaplan-Meier生存分析显示,Beclin1和LC3均阳性、mTOR阴性、无淋巴结转移的大肠癌患者5年生存率高于Beclin1和LC3均阴性、mTOR阳性及有淋巴结转移的患者。多因素分析显示,LC3、mTOR和淋巴结转移是影响大肠癌预后的独立因素。 RT-PCR和Western blot检测结果显示：Beclin1、LC3和mTOR mRNA和蛋白表达水平均明显高于癌旁组织(P<0．05)。结论自噬相关基因Beclin1、LC3和mTOR的异常表达可能与大肠癌的发生、发展及预后相关;联合检测Beclin1、LC3和mTOR在大肠癌中的表达有助于评估进展程度和预后判断。