肝细胞生长因子对肝细胞癌侵袭和转移的影响

目的:研究HGF对肝细胞癌SMMC-7721的上皮-间叶转化的作用,并对其机制进行探讨.方法:HGF处理SMMC-7721后,应用细胞培养、Transwell、划痕实验、WB技术研究HGF对肝癌细胞SMMC-7721上皮-间叶转化的作用.并应用P13 kinase抑制物LY294002 10umol/L顸处理细胞,观察SMMC-7721的变化,研究P13 kinase对于HGF作用机制的影响.结果:Transwell和划痕实验显示HGF处理的细胞侵袭和转移能力增强,蛋白印迹结果显示HGF处理的细胞的N-cad、MMP-2、MMP-9和Vimentin的表达增加,E-cad的表达减少.LY294002预处理后,细胞不再受HGF的影响,细胞的形态没有明显变化.Transwell和划痕实验结果与未经处理的SMMC-7721相同.蛋白印迹结果显示:细胞的N-cad、MMP.2、MMP-9、Vimacntin和E-cad的表达变化不明显.结论:HGF能够促进SMMC-7721的上皮间叶转化,这种作用通过PD Kinase实现.     

体外应用大鼠胰腺提取物诱导小鼠间充质干细胞分化为胰岛素产生细胞

目的 探讨大鼠胰腺提取物(RPE)是否可以使小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)分化为胰岛素产生细胞(IPCs),以及小鼠BMMSCs的分化条件,为糖尿病的干细胞治疗提供新的方法. 方法 传代纯化培养昆明小鼠的骨髓间充质干细胞,应用SD大鼠的RPE诱导分化小鼠BMMSCs为IPCs,首先取18瓶小鼠BMMSCs随机分为6组,每组3瓶,分别加入RPE 10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、100mg/L,筛选出最佳的分化剂量,然后用最佳的分化剂量(50mg/L)分化BMMSCs,免疫酶细胞化学鉴定细胞内胰岛素的表达;双硫腙染色检测胰岛素产生细胞的分化和纯度.放射免疫分析检测C肽片段表达. 结果 50mg/L RPE可以使间充质干细胞分化良好,形态较规则,1周后细胞分化成熟,双硫腙染色呈现猩红色;免疫酶细胞化学和免疫荧光细胞化学显示:胰岛素表达阳性,C肽放射免疫学显示有C肽释放. 结论 RPE可以使小鼠的骨髓间充质干细胞分化为胰岛素产生细胞.     

人GRP78蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的:构建原核表达质粒pGEX-4T-1 -GRP78,诱导表达、纯化后检测GRP78蛋白的抗原活性.方法:利用PCR方法从本实验室已构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)上扩增GRP78基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组载体pGEX-4T-1 -GRP78.转化至大肠杆菌BL21( DE3)中诱导表达,再将所表达的融合蛋白进行纯化.经SDS-PAGE分析后,将所得产物用Thrombin切割;进一步包板后用ELISA法对其抗原活性进行评价.结果:酶切和测序结果均证实GRP78原核表达载体构建正确,可诱导表达;ELISA检测显示纯化后的人GRP78抗原具有免疫原性.结论:成功构建了人GRP78基因的原核表达载体,获得了纯化的GRP78蛋白,该蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究以GRP78为基础的肝细胞癌的血清学检测提供了抗原.     

Grp78表达对人肝细胞癌细胞外信号调节激酶1/2活性和表达的影响

目的 通过检测葡萄糖调节蛋白78(Grp78)、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2在肝细胞癌手术切除组织中的表达,并在SMMC-7721细胞中干预Grp78的表达,探讨Grp78对ERK1/2激酶的调控作用。 方法 应用免疫组织化学方法（IHC）和免疫印迹法检测47例肝细胞癌手术切除组织样本中Grp78,ERK1/2的表达和ERK1/2磷酸化水平;在高表达Grp78的肝细胞癌细胞系SMMC-7721中,通过用小RNA干扰Grp78的表达来探讨Grp78表达水平,改变对ERK1/2活性及表达的影响。 结果 在肝细胞癌组织样本中,Grp78的表达情况与ERK1/2和磷酸化ERK1/2的表达明显呈正相关。在SMMC-7721细胞中Grp78高表达促进ERK1/2的磷酸化,应用RNA干扰特异性下调Grp78高表达细胞中Grp78水平可以抑制ERK1/2的磷酸化。 结论 Grp78参与调解ERK1/2信号通路,并且在肝细胞癌临床治疗方面可能成为潜在的治疗靶点。     

结直肠癌中黏着斑激酶、整合素、c-Jun氨基末端激酶的表达及相关性研究

目的 检测黏着斑激酶(FAK)、整合素Src、c-Jun氨基末端激酶(JNK)在结直肠癌组织中的表达,并探讨其与结直肠癌临床病理指标的相关性.方法 采用免疫组织化学SP法检测68例结直肠癌组织与癌旁组织中FAK、Src、JNK的表达,结合结直肠癌临床病理指标分析相关性.结果 68例结直肠癌标本中,FAK、Src、JNK的表达水平均与癌旁组织差异显著(P值分别为0.012,0.002,0.012).3者的表达水平与肿瘤分化程度呈负相关(P值分别为＜0.001,0.002,0.004;r值分别为-0.346,-0.356,-0.340),FAK表达与淋巴结转移及UICC分期相关(P值分别为0.006和0.013),但与患者性别、年龄、肿瘤的大小及位置无显著相关.FAK蛋白的表达与Src及JNK蛋白的表达呈正相关(r=0.357,P=0.001;r=0.318,P=0.047).结论 FAK、Src、JNK在结直肠癌组织中均呈高表达,与肿瘤分化程度呈负相关,且Src、JNK的表达与FAK呈正相关,提示FAK/Src/JNK信号通路在结直肠癌的发生、发展中起重要作用.     

尼克酰胺与胰腺损伤提取物诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛素产生细胞的比较

目的 探讨诱导小鼠骨髓间充质干细胞（ＢＭＳＣs）分化为胰岛素产生细胞较好的方法。 方法 大鼠胰腺提取物和尼克酰胺分别诱导小鼠的BMSCs分化,经免疫组织化学、双硫腙染色、放射免疫学方法和RT-PCR技术（Ins-1、Ins-2、Glut-2、GK）鉴定两种诱导方法诱导细胞的分化程度。 结果 两种方法诱导后的细胞均可以表达胰岛素。双硫腙染色和胰岛素免疫组织化学的染色结果发现,两种分化后的细胞无明显差异。放射免疫学检测胰岛素及C肽片段：两种分化后的细胞表达的胰岛素随25mmol/L葡萄糖刺激时间的延长产生的胰岛素分泌曲线有明显差别,尼克酰胺分化的小鼠BMSCs产生的胰岛素产生细胞（IPCs）与正常小鼠胰岛细胞的曲线一致性欠佳,而大鼠胰腺损伤提取物分化的小鼠骨髓间充质干细胞产生的胰岛素产生细胞的分泌曲线一致性很好。尼克酰胺分化后的细胞不能产生C肽片段,而大鼠胰腺损伤提取物能够表达C肽片段。RT-PCR结果显示,尼克酰胺与大鼠胰腺提取物均可以表达胰岛细胞相关的几个mRNA（Ins-1、Ins-2、Glut-2、GK）。 结论 大鼠胰腺提取物与尼克酰胺相比,可能是一种较好的诱导BMSCs分化成熟产生胰岛素的诱导剂。     

特异性下调葡萄糖调节蛋白78降低人涎腺腺样囊性癌侵袭和转移的能力

目的 探讨特异性下调葡萄糖调节蛋白78（GRP78）对涎腺腺样囊性癌（ACC）侵袭和转移能力的影响; 方法 应用siRNA干扰技术,特异性下调ACC-2细胞内GRP78的表达,通过划痕实验、Transwell实验、四甲基偶氮唑盐（MTT）实验和细胞骨架染色,观察下调GRP78表达后细胞的变化,并应用免疫印迹法检测下调GRP78表达对基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、基质金属蛋白酶抑制因子(TIMP）-1和TIMP-2的影响。 结果 划痕实验显示,下调GRP78的表达能够抑制划痕愈合;Transwell实验发现,下调GRP78在ACC-2的表达明显降低穿过的细胞数;下调GRP78表达后细胞骨架染色发现,骨架纤维明显增粗;MTT实验显示,下调GRP78后细胞的增殖能力降低1/3;免疫印迹法检测结果发现,下调GRP78表达后ACC-2细胞的MMP-2、MMP-9的表达降低,TIMP-1、TIMP-2的表达增高。 结论 特异性下调GRP78的表达能够降低ACC的侵袭和转移能力,这与GRP78参与调节MMP和TIMP的表达有关。     

肝细胞生长因子对肝细胞癌细胞系SMMC-7721黏着斑激酶的影响

目的:探讨肝细胞生长因子(HGF)对黏着斑激酶(FAK)、Src表达及活性的影响以及PI3K在该过程中的作用.方法:LY294002预处理阻断PI3K的活性、HGF处理SMMC-7721后检测FAK和Src的表达、磷酸化及在细胞内的分布. 应用免疫印迹技术检测FAK、Src的表达及磷酸化, 免疫荧光技术检测FAK在SMMC-7721细胞中的分布.结果:HGF(50 μg/L)可以促进FAK Y397位点的磷酸化, 对FAK的表达没有影响. 应用PI3K抑制物LY294002处理后, FAK Y397的磷酸化水平显著降低. HGF处理后, FAK主要位于细胞边缘, 呈簇状分布, 应用PI3K抑制物, FAK在细胞内弥散分布. HGF处理后, Src激酶和SrcY416的磷酸化水平明显增加, 而经LY294002处理后, Src激酶与Src Y416的磷酸化水平明显降低.结论:肝细胞癌中, HGF以PI3K依赖性的方式促进FAK和Src的活化.