超声造影剂联合超声介导耐药基因反义寡脱氧核苷酸转染肝癌细胞逆转多药耐药效应的研究

目的 探讨超声造影剂联合超声介导mdr1、mrp基因反义寡脱氧核苷酸(ASODN)转染QGY耐药肝癌细胞对多药耐药(MDR)的逆转.方法 分别将mdr1、mrp-ASODN+超声造影剂+超声辐照转染QGY/CDDP肝癌细胞,检测转染后细胞贴壁率、药物敏感性、耐药基因mRNA表达和相应耐药蛋白表达变化.结果 mdr1-ASODN转染后,细胞贴壁率和耐药基因mRNA表达变化大(P＜0.05),细胞药物敏感性和耐药蛋白P-gp、MRP表达变化小(P＞0.05).实验组(2组)作用更大(P＜0.05).mrp ASODN转染后,细胞贴壁率、药物敏感性、耐药基因的mRNA表达和耐药蛋白P-gp、MRP表达均变化明显(P＜0.05),实验组(2组)作用更大(P＜0.05).结论 mdr1、mrp-ASODN+超声造影剂+超声辐照能够低毒部分逆转肝癌细胞MDR,是潜在肿瘤基因治疗方法.     

槲皮素对胃癌细胞SGC-7901和BGG-823生长的影响

目的 观察槲皮素对胃癌细胞SGC-7901和BGC-823生长和增殖的影响。方法 以台盼蓝拒染法计数胃癌细胞的生长抑制率，荧光显微镜了解凋亡的发生，流式细胞术检测细胞周期变化。结果 台盼蓝拒染法计数显示槲皮素抑制SGC-7901和BGC-823细胞增殖的作用明显，呈浓度和时问依赖性，槲皮素处理48h后的Ic50为14．12μm(SGC-7901)和28．13μm(BGC-823)。形态学检测显示出细胞凋亡的特征变化，流式细胞仪检测表明经10～20μm／L的槲皮素处理，SGC-7901细胞周期阻滞于G0／G1期，BGC-823细胞周期阻滞于S期。结论 槲皮素能抑制胃癌细胞的生长并诱导其发生凋亡，是有效的抗癌药。     

耐药基因反义寡脱氧核苷酸经声学微泡及超声介导转染对QGY/CDDP细胞多药耐药的影响

肿瘤细胞多药耐药(MDR)是影响肝癌治疗效果的重要因素,因此逆转MDR成为研究肝癌治疗方法的热点之一.目前没有一个有效、靶向的肿瘤MDR逆转方法[1].本研究以声学微泡+超声+mdrl或mrp反义寡脱氧核菅酸(ASODN)逆转QGY/CDDP细胞多药耐药,探讨MDR的逆转方法及其机制.     

重组人脂联素基因在L02细胞中的表达及其对肝脂肪变的预防作用

目的 观察携带人脂联素(AdipoQ)基因真核表达载体是否能在人正常肝细胞株L02中表达,并探讨其对体外诱导肝细胞脂肪变的预防作用及其意义,为AdipoQ在非酒精性脂肪肝病的基因治疗中奠定基础.方法 将构建含人AdipoQ重组载体pEGFP-N1-AdipoQ转染L02细胞(L02/pEGFP-N1-AdipoQ组,n=10),与pEGFP-N1空质粒转染L02细胞(L02/pEGFP-N1组,n=10)以及L02正常细胞株(L02组,n=10)为对照,分别加入浓度为20 μg/ml的油酸进行培养72h,用油红O染色观察细胞内脂滴,并检测细胞内甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)和甘油的含量.采用SAS8.2软件进行统计分析,3组之间总体差异的检验采用单因素方差分析,3组之间两两比较采用SNK-q检验.结果 含人AdipoQ重组载体pEGFP-N1-AdipoQ能够在L02细胞株中表达,油红O染色显示72 h L02组和L02/pEGFP-N1组分别比L02/pEGFP-N1-AdipoQ组脂肪变性更为明显.L02组,L02/pEGFP-N1组和L02/pEGFP-N1-AdipoQ组,TG含量分别为(89.23±18.45)μmol/L、(78.66±16.38)μmol/L和(26.58±7.65)μmol/L,FFA含量分别为(85.39±17.26)μmol/L、(75.63±12.25)μmol/L和(25.37±8.73)μmol/L,甘油含量分别为(62.29±13.59)μmol/L、(57.35±18.43)μmol/L和(15.37±7.53)μmol/L,F值分别为50.58、59.37、34.32,P值均<0.01.在L02/pEGFP-N1组中TG、FFA和甘油含量均明显高于L02/pEGFPN1-AdipoQ组,t值分别为7.81、8.50、6.75,P值均<0.01.在L02组中TG、FFA和甘油含量均显著高于L02/pEGFP-N1-AdipoQ组,t值分别为9.39、10.15、7.54,P值均<0.01.TG、FFA和甘油含量在L02/pEGFP-N1组和L02组之间,差异无统计学意义.结论 携带人脂联素基因真核表达载体能够在L02细胞株中表达,而且具有预防肝脂肪变性的作用.     

标准化病人在诊断学教学中的运用

诊断学是关于疾病诊断基本理论、基本技能、基本方法的重要医学专业课程。标准化病人的引入,缓解了我国教学资源不足及医患关系紧张的矛盾,在学生基本技能及医患沟通能力培养方面显露优势。但标准化病人的应用在诊断学教学实践中存在诸多问题,对此进行分析,以寻求相关对策。     

重组质粒pBud-CD44v6的构建及其在胃癌细胞内的表达

目的 构建含人的肿瘤侵袭和转移的特异性抗原CD44v6编码基因的真核表达的重组载体,进行核苷酸序列分析,并在肿瘤细胞中表达.方法 ①以pBud作为真核表达载体,选择CD44v6编码基因进行RT-PCR扩增,构建重组表达质粒,进行酶切鉴定和测序分析.②在Lipofectamine 2000的介导下,将构建成功的pBud-CD44v6重组表达质粒转染到肿瘤细胞中,通过免疫组织化学方法检测CD44v6的表达.结果 经酶切鉴定和测序分析表明,插入的目的 基因片段为CD44v6的编码基因,长为129 bp,与GenBank中登录的cDNA相比较,同源性高达100%,且方向正确;重组质粒pBud-CD44v6转染对数生长期胃癌细胞株SGC-7901,进行免疫组织化学检测结果显示,与空质粒转染组对比,重组质粒组肿瘤细胞的细胞质中可见大量CD44v6基因编码的表达,其蛋白呈棕黄色,而对照组呈阴性.结论 成功构建了pBud-CD44v6真核表达的重组载体,并在肿瘤细胞中表达.     

重组人脂联素基因在减毒沙门氏菌中的表达

目的：构建携带人脂联素（AdipoQ）基因真核表达载体并在减毒沙门氏菌中表达,为AdipoQ对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的基因治疗提供依据.方法：从人脂肪组织中提取总RNA,通过实时荧光定量PCR（rRT-PCR）方法获得Adi-poQ基因并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,构建pEG-FP-N1-AdipoQ重组载体.重组质粒经鉴定后再电转入减毒沙门氏菌SL7207中表达.结果：克隆的人AdipoQ基因744bp测序结果显示：1个碱基发生突变,654位：A→T,突变率为0.1%,氨基酸Glu→Asp.经SDS-PAGE,Western Blot检测融合蛋白Mr约为55×10^3（绿色荧光蛋白Mr约为27×10^3）,能够被AdipoQ抗体识别.结论：成功构建携带AdipoQ基因真核表达载体的减毒沙门氏菌株,AdipoQ基因能够在减毒沙门氏菌中表达并与绿色荧光蛋白融合.为进一步研究其在NAFLD中的作用机制奠定了基础.     

sTRAIL真核表达质粒对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的 探讨可溶性肿瘤坏死因子相关捌亡诱导配体(soluble tumor necrosis factor.related apoptosis inducing lig-and,sTRAIL)真核表达质粒对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制作用. 方法 建立胃癌细胞株BGC-823裸鼠移植瘤模型,成瘤后于瘤内多点注射重组真核表达质粒pBud-EGFP-TRAIL,并设pBud-EGFP组和生理盐水组为对照,观察并记录肿瘤的生长情况.Western blot和RT-PCR检测sTRAIL mRNA和蛋白表达情况,HE染色观察肿瘤组织病理改变,TUNEL法及电镜技术观测肿瘤组织细胞凋亡情况.结果注射pBud-EGFP-TRAIL组的sTRAIL mRNA和蛋白为阳性,其瘤休大小明显小于pBud-EGFP组和生理盐水组.差异有统计学意义(P<0.05).HE染色示pBud-EGFP-TRAIL组肿瘤细胞大量死亡,电镜下可见到典型凋亡细胞,TUNEL法显示其凋亡细胞明显增多. 结论 sTRAIL真核表达质粒pBud-EGFP-TRAIL瘤内注射对人胃癌裸鼠移植瘤有抑制作用.     

短发夹RNA干扰胃癌低氧诱导因子-1α表达及其临床意义

目的 探讨RNA T扰对胃癌细胞低氧诱导因子-1α(HIF-1α)转录和蛋白表达的作用以及对胃癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 构建人HIF-1α基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体并转染胄癌细胞BGC-823;采用RT-PCR和Western blot法检测HIF-1α mRNA、蛋白表达水平;MTT法检测转染后对胃癌细胞生长的抑制;TUNEL法观察细胞的凋亡情况;流式细胞术分析转染后胃癌细胞的细胞周期和凋亡率.结果 成功构建了pshRNA-HIF-1α1和pshRNA-HIF-1α2重组质粒;转染BGC-823后,与空质粒组相比,pshRNA-HIF-1α1可有效抑制BGC-823细胞HIF-let基因转录和蛋白质表达,抑制率分别可达93.4%和55.7%;MTT法显示转染后细胞生长明显受到抑制;流式细胞术结果表明转染后,其凋亡率明显高于卒质粒绀(P＜0.05),BGC-823细胞增殖活性显著降低,G0～G1期细胞比例明显增加,S期与G2.～M期细胞比例减少;TUNEL法显爪转染后细胞核固缩,核染色质聚集或断裂;体内实验显示,pshRNA-HIF-1α1的抑瘤率为41.75%.结论 体内、外初步实验证实pshRNA-HIF-1α1能有效抑制胃癌细胞BGC-823 HIF-1α基因表达,抑制胃癌细胞增殖,诱导其凋亡.