程序降温羟乙基淀粉冷冻保存自体造血干细胞移植治疗恶性血液病

1．目的：6％羟乙基淀粉（HES）、4％白蛋白和5％二甲亚砜（DMSO）构成的保护剂的毒性较单纯的10％DMSO冷冻保护剂低,但前者用于造血干细胞非程序降温-80℃冰箱冷冻保存。该课题旨在将含羟乙基淀粉的低浓度DMSO冷冻保护剂用于程序降温冷冻保存,探讨冷冻保护剂对造血干细胞活性的影响,改进冷冻保护剂的临床应用。     

JAK2V617F突变负荷量对ET患者临床表现和生存影响的研究

目的:观察JAK2V617F突变量对ET(原发性血小板增多症)患者的临床表现及生存影响。方法:病例来源于2013.10-2016.12月在云南省第一人民医院就诊和治疗的ET患者229例,采取患者的骨髓血标本2 ml,肝素抗凝,红细胞裂解液分离单个核细胞,使用DNA抽提试剂盒抽提患者基因组DNA。利用等位基因特异性PCR方法扩增目标DNA,琼脂糖凝胶电泳筛选出120例JAK2V617F突变阳性的标本。再通过实时定量PCR(RT-PCR)检测JAK2V617F突变负荷量,并通过测序方法检测PCR筛选的准确率。结果:伴有血栓形成的ET患者JAK2V617F突变负荷量高于未发生血栓组(23.2%vs 14.2%),(P 0.05);WBC计数升高组( 10×10~9/L)及HGb浓度升高( 150 g/L)患者JAK2V617F突变负荷量高于对照组(P 0.05),17例脾肿大患者JAK2V617F基因突变负荷量高于45例脾脏未肿大组(P 0.05),年龄、性别与JAK2V617F基因突变量之间无相关性(P 0.05)。经单因素分析显示,JAK2V617F突变量对生存率无统计学影响;多因素分析显示,WBC计数、血红蛋白浓度、年龄、性别及脾肿大对生存率无影响(P 0.05)。结论:JAK2V617F突变负荷量影响ET患者的临床表现,JAK2V617F突变负荷量与是否形成血栓相关,性别、年龄与基因突变负荷量无关。     

应变率成像评价自体外周血干细胞移植术后心肌梗死患者左室局部心肌功能的临床研究

目的探讨应变（SI）及应变率成像（SRI）在急性心肌梗死（AMI）患者自体外周血干细胞移植治疗前、后左室局部心肌功能定量评价中的应用价值。方法共有65例AMI患者入选本项前瞻性、非随机、开放试验（其中35例患者为细胞移植组，30例为常规治疗组）。应用SRI、SI和多普勒速度成像（TVI）测定细胞移植组、常规治疗组治疗前、后及30名健康人的左室壁各节段的SI、SRI及TVI的参数变化。结果①65例AMI患者的589个缺血节段的心肌收缩期峰值应变率（PSSR）、舒张早期峰值应变率（PESR）、收缩期峰值应变（PSS）、心肌收缩期峰值速度（VS）和舒张早期峰值速度（Ve）显著降低，舒张晚期峰值应变率（PASR）和舒张晚期峰值速度（Va）变化差异无统计学意义。SRI和SI检出缺血心肌的敏感性、特异性及准确性明显高于TVI[（90％、91％、92％）比（71％、69％、71％），P〈0．01]。②细胞移植组随访期305个经治疗缺血心肌节段中，244个节段的PSSR、PESR、PSS、Vs及ve较术前显著增高或恢复正常，常规治疗组随访期284个经治疗缺血节段中，169个节段的PSSR、PESR、PSS、Vs及Ve较术前显著增高或恢复正常，但两组治疗后改善的缺血心肌节段数比例及SRI、TVI参数比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论SRI和SI能够无创定量评价冠心病缺血心肌节段的运动异常，为临床客观评价冠脉内自体干细胞移植术疗效提供了一种早期无创、敏感、有效的定量分析手段。     

Wortmannin抑制PI3-K途径对K562及NB4细胞增殖的影响

目的 :为探讨Wortmannin抑制磷酰肌醇 - 3激酶 (PI- 3K)途径对K5 62 ,NB4细胞增殖的影响 ,探寻慢性髓细胞性白血病 (CML)的治疗新途径 .方法 :用磷酰肌醇 - 3激酶 (PI - 3K)特异抑制剂Wort mannin抑制PI - 3K活性 ,观察慢性髓细胞性白血病细胞系K5 62细胞和急性早幼粒细胞性白血病细胞系NB4细胞在 2 4,48,72h增殖能力的变化 .t检验统计分析 .结果 :K5 62和NB4细胞在 2 4,48,72h的增殖抑制率分别为 3 4 67% ,5 7 46% ,65 85 %和 2 6 2 9% ,5 5 1% ,2 10 % .集落形成实验以GM -CSF为主要生长刺激物的培养体系在 3 7℃ ,5 %CO2 孵箱培养 14d后细胞系的集落数和集落形成率分别为K5 62 :80 75±10 2 4和 16 15 % ,K5 62 +WT :3 8 0 0± 12 75和 7 60 % ,NB4:2 9 5 0± 5 97和 5 90 % ,NB4+WT :3 0 5 0± 5 74和 6 10 % .集落形成抑制率为 :5 2 94%和 3 3 9% .结论 :Wortmannin可显著抑制K5 62细胞的增殖和集落形成 ,而对NB4细胞无明显影响 (P均 <0 0 5 ) .Wortmannin可以通过抑制PI - 3K通路抑制K5 62细胞的增殖 ,而对NB4细胞增殖无明显影响     

磷酰肌醇-3激酶途径与bcr/abl基因介导的白血病细胞增殖和抗凋亡信号传导

目的探讨磷酰肌醇-3激酶途径在K562、NB4和HL60细胞增殖和凋亡抗性中的不同作用。方法短期培养法直接法G显带检测K562细胞和CML患者骨髓原代细胞的染色体核型,RQ-PCR检测K562细胞和CML患者骨髓原代细胞的bcr/abl基因;用磷酰肌醇-3激酶特异抑制剂渥曼青霉素(WT)抑制磷酰肌醇-3激酶活性,经细胞生长曲线测定、半固体集落形成实验、流式细胞膜联蛋白V标记技术检测细胞凋亡百分比和凋亡指数。观察K562、NB4和HL60细胞增殖能力及凋亡抗性的变化。统计学采用t检验。结果K562细胞G显带检出Ph染色体,RQ-PCR检测K562细胞存在bcr/abl基因;与标准Ph染色体表达的CML患者骨髓原代细胞的bcr/abl基因完全吻合;K562、NB4和HL60细胞在24h、48h、72h的增殖抑制率分别为41.33%、57.46%、65.85%和26.29%、5.51%、2.10%及32.14%、17.14%、13.14%。生长曲线显示WT抑制磷酰肌醇-3激酶途径可显著抑制K562细胞的增殖(P<0.05),而对NB4和HL60细胞增殖无明显影响(P>0.05)。K562、NB4和HL60细胞加和不...     

程序降温冷冻保存自体造血干细胞移植治疗恶性血液病

目的　探讨程序降温冷冻保存对造血干细胞活性的影响。方法　临床观察比较 4℃保存和深低温保存两组自体造血干细胞移植患者的造血恢复时间 ,同时采用台盼蓝拒染法与流式细胞仪Annexin V PI标记法检测两组造血干细胞的活性。结果　深低温保存移植组移植后血小板上升时间较 4℃保存移植组缓慢 (但P >0 0 5 ) ,4℃保存对造血干细胞活性影响不大 ,深低温保存可引起造血干细胞发生大量凋亡和死亡 ,导致存活率明显降低。采用流式细胞仪Annexin V PI标记凋亡测定法检测造血干细胞活性的敏感性明显优于传统的台盼蓝拒染法。结论　目前临床上应用的造血干细胞冷冻保护剂仍有较大缺陷 ,需开发具有抗凋亡作用的新型冷冻保护剂。造血干细胞活性检测选用流式细胞仪凋亡测定法较为可靠。     

Wortmannin抑制PI3K途径对bcr/abl基因介导的白血病细胞增殖和凋亡抗性影响的研究

目的探讨磷酰肌醇-3激酶(PI3K)途径在K562、NB4和HL60细胞增殖和凋亡抗性中的不同作用。方法用磷酰肌醇-3激酶(PI3K)特异抑制剂Wortmannin(WT)抑制PI3K活性,经细胞生长曲线测定、半固体集落形成实验、流式细胞膜联蛋白V(Annexin-V-Flous)标记技术检测细胞凋亡百分比和凋亡指数。观察K562、NB4和HL60细胞增殖能力及凋亡抗性的变化。结果K562、NB4和HL60细胞在24、48、72h的增殖抑制率分别为41.33%、57.46%、65.85%和26.29%、5.51%、2.10%及32.14%、17.14%、13.14%。生长曲线显示WT抑制PI3K途径可显著抑制K562细胞的增殖,对NB4和HL60细胞增殖无明显影响。K562、NB4和HL60细胞加和不加WT,培养14d后的集落形成率分别为16.15%和7.60%,5.90%和6.10%,6.60%和6.40%。集落形成抑制率为52.94%、3.39%和3.03%。K562、NB4和HL60细胞加WT、AraC、WT+AraC作用24h后的凋亡细胞百分比分别为(17.27±1.94)%、(23.25±14.12)%、(17.60±1.27)%;(17.00±3.36)%、(20.55±8.57)%、(22.07±5.62)%;(27.60±4.36)%、(17.56±9.28)%、(20.50±7.97)%。凋亡指数分别为(6.88±2.66)、(7.79±2.75)、(3.03±0.56);(8.91±3.86)、(9.35±4.19)、(3.79±0.93);(13.39±4.49)、(7.61±6.35)、(5.27±2.69)。结论WT可以通过抑制PI3K通     

二甲基亚砜与羟乙基淀粉对血小板的冷冻保护作用

目的 观察二甲基亚砜(DMSO)与羟乙基淀粉(HES)联用保护剂冷冻保护血小板的效果,探寻更适合冷冻血小板的保护剂.方法 实验设未冷冻组,DMSO组,HES组,DMSO与HES联用组.各组加血小板混匀后置-80℃冰箱保存,38℃水浴融化,检测血小板回收率,MPV值,观察血小板超微结构,测定CD42b、CD62p的表达水平.结果 HES单独使用对血小板的保护作用不强;DMSO单独使用组与DMSO与HES联用组对血小板的外部形态和内部结构的保护及CD62p的表达水平,MPV增加值,后者优于前者,CD42b表达水平DMSO组优于DMSO与HES连用组.结论 DMSO与HES联用对血小板的冷冻保护有一定协同作用,它与DMSO联用可作为冷冻血小板的保护剂进一步研究.     

低温冰箱转液氮阶梯降温法冷冻保存自体外周血造血干细胞移植治疗恶性血液病的临床研究

目的探讨低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存对自体外周血造血干细胞移植的影响。方法2001年4月至2006年4月对云南省第一人民医院血液科31例行自体外周血造血干细胞移植的患者随机分为程序降温转液氮法(15例)和低温冰箱转液氮阶梯降温法(16例)两组,比较两组患者造血恢复时间,并采用台盼蓝拒染法检测两组造血干细胞的活性。结果两组单个核细胞(MNC)和CD34 细胞输入值、台盼蓝拒染率、移植后中性粒细胞(ANC)<0.5×109/L时间、血小板(PLT)<50×109/L时间比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论采用3%羟乙基淀粉、4%白蛋白和5%二甲亚砜(DMSO)组成的冷冻保护剂,通过低温冰箱转液氮阶梯降温法冷冻保存造血干细胞,可以达到和传统采用10%DMSO作为冷冻保护剂的程序降温冷冻保存法一样的临床移植效果,缩短了冷冻操作时间,减少了冷冻成本。     

不同冷冻保护剂对低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响

背景:非程序降温-80 ℃低温冰箱保存方便快捷,程序降温-196 ℃液氮保存可靠长久,将两者合二为一简化流程已成功用于临床.目的:观察不同冷冻保护剂对-80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响.方法:分设10%二甲亚砜组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉组、5%二甲亚砜联合0.25 mol/L海藻糖组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉及0.25 mol/L海藻糖组.采用 -80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温法对单采外周造血干细胞进行冷冻保存,通过透射电镜观察细胞超微结构变化,流式细胞仪观察Annexin-V、PI、Caspase-3水平.结果与结论:4组冷冻保存细胞的存活率、凋亡率和死亡率差异均无显著性意义(P > 0.05).透射电镜下各组细胞超微结构变化差异不明显.单个核细胞群落冷冻保存后存活率在90%以上,含成熟细胞较多的CD45+细胞群落凋亡发生率可达50%左右.造血干祖细胞群落中,早期细胞较晚期细胞更能耐受冷冻损伤.提示在基础冷冻保护剂二甲亚砜的基础上,加入羟乙基淀粉和海藻糖并未显示出对冷冻保存效果的增强作用.