推拿对骨骼肌急性钝挫伤模型大鼠炎症、氧化应激及细胞自噬相关因子的影响

目的 观察推拿对大鼠骨骼肌急性钝挫伤修复过程中炎症、氧化应激、细胞自噬相关因子的影响,探讨推拿治疗骨骼肌损伤可能的作用机制。 方法 采用随机数字表法将42只成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠分为正常组（n=6）、模型组（n=18）、治疗组（n=18）,模型组和治疗组再根据取材的时间点随机分为1d、7d、14d三个亚组（n=6）。模型组和治疗组用自备打击器建立腓肠肌急性钝挫伤模型,治疗组于造模48h后开始推拿治疗,每日1次,每次15min。各组分别于各自的取材时间点心脏采血后取损伤侧腓肠肌,苏木精-伊红染色(HE）观察损伤部位腓肠肌形态学变化;酶联免疫法（ELISA）检测各组大鼠血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、C反应蛋白（CRP）、前列腺素E2（PGE2）表达水平;紫外-可见分光光度法检测各组大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）,丙二醛（MDA）含量;Western blotting检测各组大鼠腓肠肌自噬微管相关蛋白1轻链3（LC3）、Bcl-2同源结构域蛋白Beclin1、泛素结合蛋白P62表达水平。 结果 骨骼肌损伤修复过程中,HE染色显示,各时间点模型组较正常组细胞形态崩塌,肿胀明显,7d和14d亚组有成肌细胞核出现。各时间点治疗组较模型组恢复更好,新生肌细胞较多,形态更趋正常。ELISA结果显示,模型组各取材时间点较正常组同取材时间点血清促炎因子明显升高,但治疗组1d和7d组较模型组同取材时间点显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）。紫外-可见分光光度法结果显示,模型组血清SOD和MDA含量较正常组明显升高,治疗组SOD较模型组同取材时间点显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）,MDA较模型组同取材时间点显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）。Western blotting结果显示,模型组各取材时间点较正常组腓肠肌LC3（II/I）、Beclin1明显降低,P62明显升高,而治疗组较模型组同取材时间点LC3（II/I）、Beclin1显著升高,P62显著降低,差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论 骨骼肌损伤后,其炎症及氧化应激水平明显升高,细胞自噬活性明显降低,通过推拿治疗能有效减轻机体炎症反应,降低其氧化应激损害,提高组织细胞自噬活性,从而加速受损组织的修复,这可能是推拿促进骨骼肌损伤修复的机制之一。     

电针干预对失神经肌萎缩大鼠肌卫星细胞分化及肌纤维类型转化的影响

目的:观察电针干预对失神经肌萎缩大鼠腓肠肌中配对盒转录因子7(Pax7)、成肌分化抗原(Myod1)、肌细胞生成素(Myog)、肌球蛋白重链-Ⅱa(Myh2)、肌球蛋白重链-Ⅱx(Myh1)及肌球蛋白重链-Ⅰ(Myh7)表达的影响,探讨电针延缓失神经肌萎缩发展的可能机制。方法:将66只雄性SD大鼠随机分为假手术组24只、模型组24只和电针组18只。采用慢性坐骨神经压迫损伤制备大鼠右后肢失神经肌萎缩模型。造模1周后电针组取大鼠术侧"足三里""环跳"穴予电针治疗,每次10min,每日1次,每周6次,分别连续干预1、2、4周。称重计算各组大鼠的腓肠肌湿重比,HE染色测定腓肠肌纤维截面积及直径;实时荧光定量PCR检测造模第3周各组大鼠腓肠肌中Pax7、Myod1、Myog、Myh2、Myh1和Myh7mRNA的相对表达量。结果:与假手术组相比,造模1周后各时间点模型组大鼠腓肠肌湿重比显著降低(P0.05)。模型组和电针组腓肠肌湿重比差异无统计学意义(P0.05)。与假手术组相比,各时间点模型组大鼠术侧腓肠肌纤维截面积及直径显著减小(P0.05);与模型组比较,各时间点电针组大鼠术侧腓肠肌纤维截面积及直径显著升高(P0.05)。造模3周时,与假手术组相比,模型组大鼠术侧腓肠肌中Myod1和Myog mRNA表达量明显升高(P0.01),而Myh2、Myh1和Myh7mRNA表达量明显降低(P0.05,P0.01);与模型组比较,电针干预则能有效上调Myod1、Myog和Myh7mRNA表达量(P0.05,P0.01);3组间Pax7mRNA表达量差异无统计学意义(P0.05)。结论:电针干预大鼠"足三里""环跳"穴可能通过调控Myod1、Myog、Myh7mRNA的表达,影响肌卫星细胞的成肌分化水平及肌纤维类型的转换,延缓腓肠肌失神经肌萎缩的发展。     

电针对失神经大鼠腓肠肌中叉头蛋白转录因子3A/肌萎缩F-box蛋白及成肌分化抗原的影响

目的:观察电针干预对失神经肌萎缩大鼠腓肠肌中叉头蛋白转录因子3A(fork-head protein,FOXO3A)、肌萎缩F-box蛋白(muscle atrophy F-box,MAFbx)和成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen,Myod1)蛋白及基因表达的影响,探讨电针延缓大鼠失神经肌萎缩的可能机制。方法:雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、模型组及电针组,每组6只。采用钳夹坐骨神经法制备大鼠失神经腓肠肌萎缩模型。电针组选取大鼠术侧"足三里""环跳"穴进行治疗,每日1次,每次10min,连续干预14d后取材。计算各组大鼠腓肠肌湿重比,HE染色测定大鼠术侧腓肠肌纤维截面积和直径,Western blot检测大鼠术侧腓肠肌中FOXO3A、MAFbx、Myod1蛋白的相对表达量,实时荧光定量PCR检测大鼠术侧腓肠肌中FOXO3A、MAFbx及Myod1mRNA的相对表达量。结果:与假手术组相比,模型组大鼠腓肠肌湿重比、肌纤维截面积和直径均显著下降(P0.01),电针组高于模型组(P0.01)。与假手术组相比,模型组大鼠腓肠肌中FOXO3A、MAFbx、Myod1蛋白及mRNA表达量显著升高(P0.01);与模型组相比,电针干预后FOXO3A、MAFbx蛋白及mRNA表达量显著降低(P0.01),Myod1蛋白及mRNA表达量显著升高(P0.01)。结论:电针可能通过抑制FOXO3A、MAFbx的表达同时上调Myod1的表达,影响骨骼肌蛋白水解的速率和肌卫星细胞分化的水平,在延缓失神经肌萎缩的同时促进肌萎缩修复。     

失神经性肌萎缩动物模型制备方法的研究进展

神经受损后,靶肌肉会不可避免地出现失神经性萎缩。按照神经损伤的来源,可将失神经性肌萎缩分为外源性失神经肌萎缩和内源性失神经肌萎缩。目前外源性失神经肌萎缩动物模型的制备方法主要包括手术制备、物理因素制备和化学因素制备,内源性失神经肌萎缩则多以肌萎缩侧索硬化症的转基因动物作为模型。选择和优化动物模型,使其更加契合临床的病理机制,是进行基础研究的关键。     

推拿联合跑台训练对急性骨骼肌损伤大鼠肌蛋白代谢相关因子的影响

目的 观察推拿、跑台训练及联合干预对急性骨骼肌损伤大鼠腓肠肌蛋白代谢信号通路相关分子雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化(p-)mTOR、p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)、p-p70S6K、Smad2/3、肌生成抑制素(MSTN)表达的影响,探讨骨骼肌修复的可能机制。 方法 采用随机数字表法将30只雄性SD大鼠分为正常组、自然恢复组、推拿组、跑台组及联合组。通过打击器制备大鼠右后肢急性骨骼肌损伤动物模型。于造模24 h后推拿组予以患侧拇指揉法干预,跑台组予以跑台训练,联合组则予以推拿及跑台训练联合干预;各组大鼠每周干预5次,连续干预3周。于干预结束后进行行为学检测,分析各组大鼠步态并统计落入电网次数,采用HE染色测定腓肠肌纤维横截面积,采用免疫印迹法检测mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K、Smad2/3蛋白相对表达量,采用实时荧光定量PCR法检测腓肠肌中MSTN mRNA相对表达量。 结果 电网打击实验结果显示,推拿组、跑台组及联合组被打击次数均较自然恢复组明显减少(P<0.05)。推拿组、跑台组及联合组肌纤维横截面积、患侧腓肠肌湿重均较自然恢复组明显增加(P<0.05);且跑台组、联合组肌纤维横截面积亦较推拿组明显增大（P<0.05）。与正常组比较,自然恢复组、推拿组、跑台组及联合组mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K蛋白相对表达量均明显升高(P<0.05),Smad2/3蛋白相对表达量和MSTN mRNA相对表达量均明显降低(P<0.05);与自然恢复组比较,推拿组、跑台组及联合组mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K蛋白相对表达量均明显升高(P<0.05),Smad2/3蛋白相对表达量及MSTN mRNA相对表达量均明显减少(P<0.05);与推拿组比较,跑台组及联合组mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K蛋白相对表达量均明显增加(P<0.05),Smad2/3蛋白相对表达量及MSTN mRNA相对表达量均明显降低(P<0.05)。 结论 早期推拿、跑台训练及联合干预均可能通过抑制Myostatin-Smad2/3信号通路,促进mTOR-p70S6K信号通路来增加急性骨骼肌损伤大鼠肌蛋白合成,促进肌肉肥大,改善损伤后腓肠肌结构及功能,且以跑台训练及跑台训练联合推拿干预的疗效较显著。     

推拿对失神经肌萎缩大鼠肌特异性microRNA和肌卫星细胞增殖分化相关因子的影响

目的 探讨推拿对失神经骨骼肌萎缩的延缓效应及其可能机制。方法 42只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组(n = 6)、模型组(n = 18)和推拿组(n = 18)。假手术组游离右侧胫神经,模型组和推拿组游离并切除右侧胫神经约1 cm。术后第2天起,推拿组在损伤局部行推拿干预,假手术组和模型组仅固定不干预。模型组和推拿组分别于术后14 d、21 d、28 d各处死6只大鼠,假手术组术后28 d处死,取术侧腓肠肌测定湿重比,HE染色观察腓肠肌细胞直径和面积,逆转录实时定量聚合酶链反应检测各时间点配对盒转录因子(Pax7)、成肌分化抗原(MyoD)和肌细胞生成素(MyoG)表达,以及21 d时microRNA-1、microRNA-133a、microRNA-206的表达。结果 与假手术组相比,模型组和推拿组各时间点腓肠肌湿重比、肌细胞直径、肌细胞面积(除14 d推拿组)均下降(P < 0.05);与模型组相比,推拿组各时间点腓肠肌湿重比、肌细胞直径、肌细胞面积均升高( P < 0.05)。与假手术组相比,模型组14 d时Pax7表达升高( P < 0.05)、28 d时表达降低( P < 0.05),推拿组各时间点(除28 d) Pax7表达明显升高( P < 0.05);与模型组相比,推拿组各时间点Pax7表达升高( P < 0.05)。与假手术组相比,模型组和推拿组各时间点MyoD、MyoG表达均升高( P < 0.05);与模型组相比,推拿组各时间点MyoD、MyoG (除14 d)表达均升高( P < 0.05)。21 d时,与假手术组相比,模型组和推拿组microRNA-1和microRNA-133a表达明显下降( P < 0.05),microRNA-206表达明显升高( P < 0.05);与模型组相比,推拿组microRNA-1、microRNA-133a和microRNA-206表达升高( P < 0.05)。 结论 推拿可能通过上调肌特异性microRNA的表达,促进Pax7/MyoD/MyoG通路转录,从而促进肌卫星细胞增殖分化,延缓失神经肌萎缩。     

巨刺干预对骨骼肌钝挫伤大鼠肝细胞生长因子表达的影响

目的:观察巨刺干预对骨骼肌钝挫伤大鼠肝细胞生长因子(HGF)的影响,探讨巨刺治疗骨骼肌钝挫伤的机制。方法:将SD大鼠54只随机分为空白组(6只)、模型组(24只)、巨刺组(24只),模型组与巨刺组再分为1、3、5、7 d 4个亚组,每亚组6只。空白组不做处理,模型组与巨刺组采用自制打击装置建立骨骼肌钝挫伤模型。损伤后24 h,巨刺组选取健侧"足三里"及患侧阿是穴对应的健侧处进行电针干预,每次15 min,每天1次,4个亚组分别治疗1、3、5、7 d;模型组不干预,4个亚组分别在损伤后1、3、5、7 d取材。HE染色观察大鼠腓肠肌形态变化,免疫组化检测增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞率,Western blot检测HGF和PCNA表达量。结果:(1)HE显示,损伤后1 d,巨刺组腓肠肌炎性细胞少于模型组;损伤后3、5 d,巨刺组成肌细胞及肌管多于模型组;损伤后7 d,巨刺组新生肌细胞多于模型组。(2)免疫组化结果显示,损伤后1、3、5 d,巨刺组PCNA阳性细胞率均显著高于模型组(均P0.001);损伤后7 d,巨刺组PCNA阳性细胞率显著低于模型组(P0.001)。(3)免疫印迹结果显示,损伤后1、3、5 d,巨刺组HGF和PCNA蛋白表达量均显著高于模型组(均P0.05);损伤后7 d,巨刺组中HGF和PCNA表达量显著低于模型组(均P0.05)。结论:巨刺可调控骨骼肌钝挫伤大鼠HGF的表达,促进损伤骨骼肌肌卫星细胞激活、增殖、迁移和分化,加快骨骼肌损伤修复进程。     

电针对大鼠失神经腓肠肌中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/70KD核糖体蛋白S6激酶信号通路的影响

目的探讨电针延缓大鼠失神经骨骼肌萎缩的可能机制。方法雄性Sprague-Dawley大鼠18只随机分为假手术组(n=6)、模型组(n=6)和电针组(n=6)。后两组钳夹伤右侧坐骨神经制备失神经骨骼肌萎缩模型。造模后第2天,电针组电针右侧足三里穴和环跳穴,共2周。取双侧腓肠肌称重,计算腓肠肌湿重比;HE染色测量肌纤维横截面积和直径;Western blotting检测大鼠骨骼肌中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR (p-mTOR)、70KD核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)和磷酸化p70S6K (p-p70S6K)蛋白表达;实时定量聚合酶链反应检测大鼠骨骼肌中mTOR、p70S6K基因表达。结果与假手术组相比,模型组和电针组腓肠肌湿重比、肌纤维横截面积及直径显著下降(P0.001),电针组明显高于模型组(P0.01)。与假手术组相比,模型组右侧腓肠肌mTOR、p-mTOR、p70S6K和p-p70S6K蛋白表达升高(P0.01);电针组高于模型组(P0.05)。与假手术组相比,模型组右侧腓肠肌mTOR、p70S6K基因表达升高(P0.05);电针组高于模型组(P0.05)。结论电针可延缓失神经骨骼肌萎缩,可能与激活mTOR/p70S6K信号通路,影响骨骼肌蛋白合成有关。     

电针联合雪旺氏细胞移植对脊髓压迫性损伤后脊髓内CD4、CD8表达及髓鞘修复的影响

目的:观察电针联合雪旺氏细胞(SCs)移植对脊髓压迫性损伤(CSCI)后损伤部位CD4、CD8表达的影响及髓鞘修复的程度,探讨电针联合SCs移植对CSCI后髓鞘修复的作用机制。方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组、电针组、雪旺氏细胞组、联合组,每组9只。采用自制脊髓压迫装置制备CSCI大鼠模型。电针组造模后次日予电针大鼠双侧"足三里""三阴交"穴,留针10min,每日1次,治疗3周。雪旺氏细胞组造模后1周进行SCs移植治疗。联合组给予电针和SCs移植治疗。BBB评分评定各组大鼠解压后不同时间的运动功能。HE染色观察损伤脊髓局部病理变化,LFB染色和免疫荧光法观察髓鞘的修复和SCs移植后的存活情况及髓鞘碱性蛋白(MBP)、外周髓磷脂P0蛋白(P0)表达,Western blot法检测大鼠损伤脊髓局部CD4、CD8、P0的相对表达量。结果:与正常组比较,模型组各时点BBB评分显著降低(P0.001);与模型组比较,联合组第2、3周时BBB评分均显著升高(P0.05);第3周时,联合组BBB评分高于电针组(P0.05)。LFB染色显示:模型组脊髓损伤区域白质纤维排列紊乱,髓鞘脱失,有髓神经纤维减少;电针组和雪旺氏细胞组脊髓损伤区域白质纤维排列紊乱减轻,有髓神经纤维增多;联合组脊髓损伤区域白质纤维排列紊乱及髓鞘丢失改善,有髓神经纤维增多。HE染色显示:模型组脊髓形态结构不完整,脊髓组织中可见大量缺损空洞,大量神经元核固缩;电针组和雪旺氏细胞组脊髓结构排列紊乱和破坏减轻,损伤区域较多神经元核固缩;联合组脊髓组织结构较清晰,正常神经细胞增多,神经元核固缩减少。免疫荧光显示:与正常组比较,模型组MBP显著减少(P0.001)、P0显著增加(P0.001);与模型组比较,电针组、雪旺氏细胞组、联合组MBP、P0表达均明显增多(P0.01,P0.001);与电针组和雪旺氏细胞组比较,联合组MBP、P0表达均明显增多(P0.001)。与雪旺氏细胞组比较,联合组Hoechst33342标记的SCs显著增多(P0.05)。Western blot显示:与模型组比较,雪旺氏细胞组CD4、CD8蛋白表达显著升高(P0.05);与雪旺氏细胞组比较,联合组CD4、CD8蛋白表达显著降低(P0.05)。与模型组比较,电针组、雪旺氏细胞组、联合组P0的表达均显著升高(P0.05);与电针组和雪旺氏细胞组比较,联合组P0的表达均显著升高(P0.05)。结论:电针联合SCs移植治疗可减少SCs移植后的免疫排斥反应,提高SCs的存活率,提高SCs的成髓鞘化功能,改善CSCI神经运动功能。     

电针对失神经大鼠骨骼肌自噬相关基因表达的影响

目的探讨电针延缓大鼠失神经骨骼肌萎缩的可能机制。方法 21只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组(n=7)、模型组(n=7)和电针组(n=7)。后两组切断右侧坐骨神经制备大鼠失神经骨骼肌萎缩模型。造模后1 d,电针组电针术侧足三里和环跳穴。干预8周后取双侧腓肠肌,称重,计算各组大鼠腓肠肌湿重比;HE染色测量肌纤维截面积和直径;逆转录实时定量聚合酶链反应检测大鼠术侧腓肠肌中自噬相关基因ULK1、Atg13、Beclin1、Atg14、Atg7、Atg12、Atg5和Atg16L1 m RNA表达。结果与假手术组相比,模型组和电针组术侧腓肠肌湿重比、肌纤维截面积及直径显著下降(P0.001),但电针组高于模型组(P0.05)。与假手术组相比,模型组术侧腓肠肌中ULK1、Atg13、Beclin1、Atg14、Atg7、Atg12、Atg5和Atg16L1 m RNA表达量显著升高(P0.001);与模型组相比,电针组以上m RNA表达量均下降(P0.05)。结论电针干预可能通过调控自噬相关基因的表达,抑制自噬过度激活,从而维持骨骼肌细胞稳态,延缓失神经骨骼肌萎缩。