核转录因子-B(p65)在羊瘙痒因子139A感染小鼠脑组织中变化的研究

目的 研究NF-B（p65）在羊瘙痒因子139A感染小鼠脑组织中的变化。方法 通过蛋白质免疫印迹法及免疫组织化学的方法检测p65在139A感染的脑组织均浆中的含量变化。利用免疫荧光方法检测p65在神经元及胶质细胞中的分布情况。结果 在139A感染终末期小鼠脑组织均浆中，p65含量下降，差异有统计学意义。对感染不同时间点的动态分析结果显示，p65含量呈先升高随后逐渐降低趋势。免疫组织化学显示，139A感染终末期小鼠大脑皮层p65含量明显下降。免疫组织荧光显示在正常和139A感染终末期小鼠脑组织中，p65与神经元细胞存在共定位现象。结论 NF-B（p65）在小鼠中枢神经系统中主要分布于神经元细胞，在139A感染的小鼠终末期脑组织中，p65总量明显下降，提示在139A感染的小鼠脑组织中，NF-B（p65）出现了变化，在疾病进程中发挥一定作用。     

遗传性朊病毒病额叶脑组织差异蛋白质组学研究CSCD

目的 应用蛋白质组学方法,筛选遗传性朊病毒病（Prion disease）额中回皮质差异表达蛋白以探究朊病毒病的发病机制和干预靶点.方法 对我国经临床、病理及分子生物学方法确诊的3例遗传性朊病毒病尸检脑组织额中回皮质,以3例同年龄组的心脏猝死且无神经系统病变的尸检脑组织为对照,进行了差异蛋白质组研究.应用荧光双向差异凝胶蛋白电泳、MALDI-TOF/MS串联质谱仪进行差异蛋白质谱分析.Mascot search results软件进行搜库,确定差异表达蛋白.结果 表达上调的蛋白有：半乳糖凝集素-1（Galectin-1,Gal-1）;泛素（Ubiquitin）;兰尼碱受体2（Ryanodine receptor 2,RyR2）;肌动蛋白结合蛋白（Profilin-2,PFN2）;Rab相互作用溶酶体蛋白样蛋白-1（Rab-interacting lysomes protein-like protein 1,RILPL-1）;髓鞘碱性蛋白异构体4（Isoform 4 of myelin basic protein）;表达下调的蛋白是血色素β亚单位（Hemoglobin subunit beta）.结论 结合文献分析其中泛素、Gal-1、RyR、PFN2和RILPL-1可能与遗传性朊病毒病发病机制关系更为密切.Gal-1可能在朊病毒病中发挥内源性神经保护机制;RyR2与记忆及肌阵挛有关;泛素、RILP-1与错误折叠蛋白质清除有关;PFN2可能与神经变性病的轴浆运输障碍有关.     

我国散发型克-雅病失能等级及权重初步评定

目的评定我国散发型克–雅病（sCJD）的失能等级及权重。方法以六级社会功能分级标准制定我国sCJD失能分级标准,通过德尔菲法、专家视觉模拟评分法（VAS）获取失能权重。结果德尔菲法得到sCJD平均失能权重为0.920,专家VAS得到sCJD失能权重中位数为0.850。结论sCJD患者健康状况差、失能权重高,应给予相应的社会关注,加大朊病毒领域研究,以早日获得防治方法。     

朊病毒病实验室生物安全风险控制特点分析

朊病毒病（prion disaese）或可传播性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathies,TSEs）是一类侵袭人类及多种动物中枢神经系统的退行性脑病,潜伏期长,100％病死率.人类的朊病毒病有克-雅病（Creutzfeldt-Jacob disease,CJD）,包括散发型、家族遗传型、医源型、变异型CJD（variant CJD,vCJD）,另外还有库鲁病（Kuru）、GSS综合征（Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome）、致死性家族型失眠症（fatal familial insomnia,FFI）,其致病因子是朊病毒.朊病毒为微小的蛋白感染颗粒,不包含核酸,与常规病毒不同[1].目前认为朊病毒是由在正常哺乳动物脑组织中存在的PrP蛋白（PrPC）经过构象转变而形成,又称PrPSc.在朊病毒患者中枢神经组织中可以检出异常致病蛋白PrPSc的沉积[1],但不同的朊病毒病具有不同的特点,主要表现在临床特征、潜伏期、脑组织中prpsc的分布、脑组织损伤的特点、能否诱导淀粉样变化,以及朊病毒的分子特征等,具有明显的＆quot;毒株＆quot;差异.鉴于朊病毒不同于传统病毒,具有独特的实验室检测技术[2],因此存在独特的生物风险形式.本文从朊病毒病原学特点和常见实验检测技术方面分析朊病毒实验活动中的生物风险形式,并提出相应的预防措施.     

人朊蛋白相关蛋白Shadoo的表达、纯化及抗体的制备

目的克隆、表达和纯化人朊蛋白相关Shadoo（SHO）蛋白并制备抗Shadoo的多克隆抗体。方法提取仓鼠各组织的mRNA，分析SHO基因在仓鼠各组织中转录水平的差异;提取人DNA，PCR方法获得人SHO基因，克隆至融合表达载体，在大肠埃希菌中表达人SHO蛋白并纯化;以纯化蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清，用Western blot方法分别检测与重组及内源性SHO蛋白的免疫反应性。结果SHO基因在仓鼠各组织中的转录水平差异很大，脑组织转录水平高。在大肠埃希菌中表达了分子质量单位为37 ku的人SHO融合蛋白，制备的SHO蛋白抗体可与重组的SHO蛋白反应，可识别内源性的SHO。结论成功表达纯化人SHO融合蛋白并制备了抗SHO抗体，为研究SHO和正常朊蛋白之间的关系打下初步基础。     

人tau蛋白外显子2和外显子3特异性抗体的制备

目的 制备人微管相关蛋白tau N端的外显子2和外显子3特异性多克隆抗体.方法 从人外周血DNA中获得tau蛋白外显子2及外显子3序列并连接至原核表达载体pGEX-2T,表达纯化重组融合蛋白GST-E2、GST-E3;以此融合蛋白免疫家兔及小鼠制备抗血清,通过ProteinG/A、偶联GST蛋白的溴化氰(CNBr)活化柱对抗血清进行亲和纯化;用Western Blot及ELISA方法确定所制备抗体的特异性和敏感性.结果 在大肠埃希菌中表达纯化出人tau外显子2和外显子3重组融合蛋白GST-E2和GST-E3,相对分子质量为29×103.免疫实验动物后获得抗血清,经系列纯化后Western Blot和ELISA检测显示,制备的抗人tau蛋白外显子2和外显子3抗体具有良好的特异性和免疫反应效价.结论 成功制备了4种人tau外显子2和外显子3特异性抗体,为进行tau蛋白在神经退行性疾病中的作用研究提供了基础.     

中国2013年克雅氏病监测网络病例特征分析

目的了解中国(未包括香港、澳门和台湾地区,以下同)克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease,CJD)的发病情况、流行病学及临床特征。方法对2013年我国克雅氏病监测网络获得的可疑CJD病例的临床及流行病学资料进行分析,收集患者脑脊液及血液样品,利用Western blot方法检测脑脊液中14-3-3蛋白,提取全血基因组DNA并利用聚合酶链反应(PCR)及测序方法对PRNP基因进行129位和219位氨基酸多态性及基因突变的分析。结果发现散发型克雅氏病临床诊断病例116例(38.80%),疑似诊断病例25例(8.36%),遗传型克雅氏病病例9例(3.01%),致死性家族型失眠症(FFI)3例(1.00%)。病例报告无季节聚集性,长期居住地呈散在分布,职业分布广泛。临床诊断病例平均年龄为61岁(32,86),男女性别比为0.87∶1;疑似诊断病例平均年龄为53岁(21,78),男女性别比为0.79∶1。快速进行性痴呆为最常见的首发症状。临床诊断病例中,同时出现3种及以上典型临床表现的病例所占比例比疑似诊断病例要高。脑脊液14-3-3蛋白、脑电图EEG以及头颅磁共振成像(MRI)3项检测结果中,出现阳性结果越多的病例表现出更多的典型症状。对283份血液样品PRNP基因的检测,其中278例129位氨基酸为M/M纯合子,277例219位氨基酸为E/E纯合子。结论 2013年我国监测到的克雅氏病病例的报告时间、长期居住地、职业、性别比例以及年龄分布均符合散发型克雅氏病的发病特点。临床诊断病例表现出更多的典型症状和阳性检测结果。     

依达拉奉对大鼠肺热缺血再灌注损伤保护作用的实验研究

目的通过建立大鼠在体肺热缺血再灌注模型,探讨依达拉奉对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用及可能机制。方法40只大鼠随机分为5组,每组8只：①假手术组（A组）,仅作开胸处理,静脉注射生理盐水3mL／kg;②缺血再灌注组（IR组）,左肺接受45min的缺血,然后接受120min的再灌注,缺血前静脉注射生理盐水3mL／kg;③依达拉奉不同剂量治疗组（C1、C2、C3组）,缺血前5min静脉注射稀释剂量的依达拉奉,左肺接受45min的缺血后再接受120min的灌注。实验结束时,留取各组动物的血液样本及左肺组织,测定血浆丙二醛（MDA）含量及肺组织匀浆超氧化物岐化酶（SOD）活性、诱导性一氧化氮合酶（iNOS）活性、肺组织的湿／干比（w／D）。结果IR组与假手术组相比W／D、MDA含量、iNOS活性均明显升高,SOD活性明显降低;依达拉奉组与IR组相比,C2、C3组W／D、iNOS活性均显著降低（P〈0．01）,C1组差异无统计学意义（P〉0．05）;MDA含量显著降低,SOD活性明显升高,差异均有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。结论依达拉奉可通过清除氧自由基、抑制脂质的过氧化、抑制iNOS的表达、减轻缺血再灌注细胞毒性作用而减轻炎症反应,对大鼠原位热缺血再灌注损伤有一定保护作用。