朊病毒病实验室生物安全风险控制特点分析

朊病毒病（prion disaese）或可传播性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathies,TSEs）是一类侵袭人类及多种动物中枢神经系统的退行性脑病,潜伏期长,100％病死率.人类的朊病毒病有克-雅病（Creutzfeldt-Jacob disease,CJD）,包括散发型、家族遗传型、医源型、变异型CJD（variant CJD,vCJD）,另外还有库鲁病（Kuru）、GSS综合征（Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome）、致死性家族型失眠症（fatal familial insomnia,FFI）,其致病因子是朊病毒.朊病毒为微小的蛋白感染颗粒,不包含核酸,与常规病毒不同[1].目前认为朊病毒是由在正常哺乳动物脑组织中存在的PrP蛋白（PrPC）经过构象转变而形成,又称PrPSc.在朊病毒患者中枢神经组织中可以检出异常致病蛋白PrPSc的沉积[1],但不同的朊病毒病具有不同的特点,主要表现在临床特征、潜伏期、脑组织中prpsc的分布、脑组织损伤的特点、能否诱导淀粉样变化,以及朊病毒的分子特征等,具有明显的＆quot;毒株＆quot;差异.鉴于朊病毒不同于传统病毒,具有独特的实验室检测技术[2],因此存在独特的生物风险形式.本文从朊病毒病原学特点和常见实验检测技术方面分析朊病毒实验活动中的生物风险形式,并提出相应的预防措施.     

剖宫产术后再次妊娠超声介导下无痛人流368例临床分析

目的 探讨超声介导下剖宫产术后再次妊娠无痛人流的优越性.方法 收集2008年4月1日-2009年10月31日剖宫产术后再次妊娠在我院无痛人流手术588例,其中368例为观察组;220例作为对照组,比较两组手术时间、出血量及术中并发症如子宫穿孔、漏吸等;术后近期并发症如：吸宫不全、感染、颈管或宫腔粘连等.结果 观察组平均手术时间3分钟,对照组平均手术时间5分钟,差异有显著性（P〈0.05）;术中出血量〉10 ml观察组23例,对照组18例,B超监视的可视人工流产定位准确,手术创伤小,时间短,出血量明显减少,两组术中出血量平均分别为12 ml和20 ml,差异有显著性（P〈0.05）.子宫收缩不良：观察组56例,对照组40例,差异无显著性（P〉0.05）.子宫穿孔：观察组0例,对照组4例,差异有显著性（P〈0.05）.漏吸：观察组1例,发生于2次剖宫产术后再次妊娠者,术前腹部B超诊断为宫内妊娠,术中无法定点清除孕囊,后经阴道彩超证实为右侧宫角妊娠.对照组1例,发生于子宫过度后倾后曲者.结论 超声介导下无痛人流术,手术快、出血少,可以最大程度减少术中及术后近期并发症.     

抗人转录因子TFDP3和TFDP1多肽抗体的制备

目的：制备兔抗人转录因子TFDP3、TFDP1的多克隆抗体,并鉴定其反应性及特异性。方法：选择TFDP3和TFDP1差异较大肽段,利用人工合成多肽免疫家兔,采用真核表达载体瞬时转染HEK293细胞表达TFDP3和TFDP1真核蛋白,通过Western blot分析抗体的反应性和特异性。结果：通过氨基酸序列比对选择TFDP3 17-26,TFDP1 17-32氨基酸残基合成多肽,制备了兔抗人TFDP3、TFDP1多肽抗体,Western blot检测显示,抗TFDP3抗体可以特异性识别TFDP3,而抗TFDP1抗体既可识别TFDP1又可与TFDP3结合。结论：制备了兔抗人TFD31和TFDP1的多肽抗体,且TFDP3抗体与TFDP1无交叉反应。     

抗人转录因子DP3和TFDP1多肽抗体的制备

目的: 制备兔抗人转录因子TFDP3、 TFDP1的多克隆抗体, 并鉴定其反应性及特异性.方法: 选择TFDP3和TFDP1差异较大肽段, 利用人工合成多肽免疫家兔, 采用真核表达载体瞬时转染HEK293细胞表达TFDP3和TFDP1真核蛋白, 通过Western blot分析抗体的反应性和特异性.结果: 通过氨基酸序列比对选择TFDP3 17-26, TFDP1 17-32氨基酸残基合成多肽, 制备了兔抗人TFDP3、 TFDP1多肽抗体, Western blot检测显示, 抗TFDP3抗体可以特异性识别TFDP3, 而抗TFDP1抗体既可识别TFDP1又可与TFDP3结合.结论: 制备了兔抗人TFD31和TFDP1的多肽抗体, 且TFDP3抗体与TFDP1无交叉反应.     

不同剂量羊瘙痒因子263K颅内感染仓鼠临床终末期脑中GFAP表达的研究

目的 研究不同剂量羊瘙痒因子263 K经颅内注射感染仓鼠后,在发病的终末期星形胶质细胞增生程度是否与注射剂量及潜伏期长短有关.方法 以胶质纤维酸性蛋白(glial fibrill aryacidic protein,GFAP)作为星形胶质细胞增生的分子标志物,采用Western Blot和免疫组化方法检测感染仓鼠终末期脑匀浆和脑组织病理切片中的GFAP表达,经定量分析比较各感染剂量组间是否存在差异.结果与正常对照相比,不同剂量感染仓鼠发病终末期脑组织GFAP阳性细胞数量和总GFAP含量均明显升高,但各感染剂量组间无显著差异.结论 不同感染剂量羊瘙痒因子263K经颅内注射感染仓鼠在发病终末期脑中星形胶质细胞的增生程度相似,与感染剂量及潜伏期无关联性.     

中国2008年克雅氏病监测病例特征分析

目的 了解中国克雅氏病(CJD)的发病情况及流行病学、临床特征.方法 对2008年中国克雅氏病监测网络获得的可疑CJD病例的临床及流行病学资料进行分析,收集患者脑脊液及血液样品,利用Western blot方法榆测脑脊液中是否含有14-3-3蛋白,提取全血基因组DNA并利用PCR及测序方法对脚基因进行129位多态性及基因突变分析.结果 共发现散发型CJD临床诊断病例31例,疑似诊断病例11例,2例家族性CJD和1例格-斯-斯综合征.病例的地理分布及职业无明显聚集性;临床诊断病例发病平均年龄56.7岁,男女比例8:9;疑似诊断病例发病平均年龄为57.4岁,男女比例5:6.快速进行性痴呆为最常见的首发症状,占全部诊断病例的33.3%.临床诊断病例比疑似诊断病例出现更多的典型临床表现.结论 2008年中国监测到的CJD病例以散发型为主,病例的地理分布、职业、性别比例以及平均年龄均符合散发型CJD的分布特点.     

HLA-A2限制性NY-ESO-1b肽段诱导的CD8+ T细胞对稳定表达NY-ESO-1的HepG2肝癌细胞系的杀伤效应

目的:分析体外诱导的NY-ESO-1特异性杀伤性T淋巴细胞对稳定表达NY-ESO-1蛋白的肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞系的杀伤效应,为进一步分析NY-ESO-1蛋白作为疫苗用于治疗HCC的可能性提供实验支持.方法:从HLA-A2阳性的肝癌患者体内分离出外周血单个核细胞,用NY-ESO-1肽段体外诱导特异性杀伤性T淋巴细胞,并通过酶联免疫斑点法分析特异性杀伤性T淋巴细胞对稳定表达NY-ESO-1蛋白的HCC细胞系HepG2细胞的杀伤效应.结果:转染了NY-ESO-1的HepG2细胞(HLA-A2 )可有效地被NY-ESO-1157-165抗原肽诱导的特异性CD8 T淋巴细胞所识别.效应细胞中大量GrB的释放表明其对稳定转染了NY-ESO-1基因的HepG2细胞有很强的杀伤作用.结论:HepG2细胞中表达的NY-ESO-1蛋白可被此肝癌细胞有效地加工处理,而且HLA-A2限制性的抗原肽NY-ESO-1157-165也可被有效地提呈到细胞表面,从而被效应T细胞所识别.     

自噬与病毒复制

自噬是真核生物中一类保守的胁迫机制,是溶酶体蛋白降解途径的主要形式之一.自噬通过降解衰老损伤的细胞器和老龄蛋白维持细胞内稳态(homeostasis),同时通过吞噬细胞内微生物病原体行使天然免疫功能.在不同病毒感染过程中,自噬也可以发挥不同的作用：既能阻止病毒复制也可以促进病毒复制.当自噬发挥抗病毒作用时,通过包裹病毒...     

我国人类朊病毒病检测监测体系建立及相关基础和应用研究

目的在我国开展克雅氏病(CJD)监测,探讨朊病毒病的发病机制。方法采用多学科交叉技术开展以疾病监测为导向的应用研究和发病机制为导向的基础研究。结果建立了CJD病原学诊断技术,制定了《克雅氏病诊断标准》,开展了覆盖12个省(市)自治区的CJD监测。首次较全面地了解了我国CJD病人的流行病学、临床和实验室特征;首次报道了我国多种遗传型CJD病例。建立了包括朊病毒实验动物平台、体外无细胞转化平台、PMCA平台、PrPSc抗原库等技术平台。首次发现了朊病毒可利用脾脏和肌肉组织进行复制、NADPH可促进PrPSc增殖;系统描述了PrPSc和其他神经因子在疾病潜伏期和终末期的变化;报道了PrP蛋白与多种神经蛋白发生相互作用;证明了PrP蛋白序列、二级结构、糖基化类型及胞内存在位置的改变均可诱导细胞凋亡。结论本研究直接服务于我国朊病毒病的防控工作,为朊病毒的研究积累了重要的科学数据。     

信号蛋白14-3-3 β及其缺失突变体与朊蛋白体外相互作用的初步研究

目的 确定PrP蛋白与14-3-3蛋白是否发生分子间的相互作用,以及相互作用区域.方法 表达纯化PrP和人14-3-3 β及其缺失突变体.通过Pull-down和免疫共沉淀方法研究全长人14-3-3 β及缺失突变体与PrP蛋白是否发生分子间相互作用以及相互作用的区域.结果 14-3-3 β能与PrP23-231发生体外的相互作用,且与PrP相互作用的区域位于14-3-3 β N端第1位至38位氨基酸.结论 首次证实人14-3-3 β与PrP相互作用的区域位于14-3-3 β N端第1位至38位氨基酸.