2009-2017年江苏省手足口病病原谱及柯萨奇A16型的分子流行病学研究

目的 描述2009-2017年江苏省手足口病(HFMD)病原谱及柯萨奇A16型(CVA16)的流行病学、基因变异及遗传进化特征。方法 对2009-2017年江苏省手足口病发病资料和病原学检测情况进行统计分析,选取120株CVA16病毒分离株进行VP1区全长基因序列测定,并对核苷酸及氨基酸序列进行同源性比较及系统进化分析。结果 2009-2017年江苏省共报告手足口病1 013 771例。其中, 手足口病肠道病毒阳性病例37 389例,主要病原构成为EV71(39.85%)和CVA16(30.13%);重症病例中,以EV71为主要病原,CVA16及其他肠道病毒引起的重症病例较少。CVA16在每年的3~7月和9~11月出现流行高峰,主要感染1~4岁年龄段儿童,男性比例高于女性。江苏省地区流行的CVA16毒株属于B1a亚型和B1b亚型,其中B1b亚型为优势流行基因亚型。120株CVA16病毒分离株VP1区核苷酸及编码氨基酸序列同源性分别为87.5%~100%、97%~100%。结论 2009-2017年,江苏省地区流行的CVA16具有明显的时间、人群分布特征;120株CVA16分离株属于B1a亚型和B1b亚型。CVA16分离株核苷酸序列变异较大,但氨基酸同源性较高,推断存在一定的同义突变。     

小儿病毒性脑炎脑电图分析

目的:探讨脑电图对小儿病毒性脑炎早期诊断及预后诊断的临床价值.方法:将脑电图结果与头颅CT结果进行比较,分析不同时期的临床诊治效果.结果:在86例病例中脑电图阳性率87.21%,CT阳性率32.56%,俩组比较差异显著(P<0.01).早期病例56例全部治愈,治愈率100%;中期病例20例,治愈率80%,好转4例;极期4例,好转2例,死亡2例.不同时期病例治愈率存在显著性差异.结论:脑电图对病毒性脑炎检测的阳性率高,而且出现异常改变早,而CT阳性率低,出现改变时间较晚.如果病人能早期诊疗可痊愈,一般不留后遗症.脑电图对小儿病毒性脑炎的早期诊断及预后判断有重要临床价值.     

抗柯萨奇病毒A组10型中和抗体检测用毒株的应用研究

目的 研究抗柯萨奇病毒A组10型（Coxsackievirus A10,CV-A10）中和抗体检测用毒株的应用。方法 对CV-A10毒株进行扩增培养,建立3级种子批并进行相关检定。采用3人3次独立测定病毒滴度,对工作种子批进行滴度标定,通过分别与肠道病毒71型（enterovirus A71,EV-A71）、CV-A16、CV-A6免疫血清进行交叉中和反应,评价该毒株的专属性。对CV-A10自然感染人血清和CV-A10小鼠免疫血清样品进行中和抗体效价检测,对其应用进行评价研究。结果 获得一株CV-A10中和抗体检测用毒株,3级种子批的无菌检查、支原体检查等项目均符合中国药典2020年版三部相关要求;经标定,平均病毒滴度为7.903 lg半数细胞培养物感染量（50% cell culture infectious dose,CCID₅₀）/ml（95%置信区间：7.868~7.937 lgCCID₅₀/ml）,变异系数为1.10%;与EV-A71、CV-A16、CV-A6免疫血清无交叉反应,专属性良好;检测CV-A10自然感染人血清和CV-A10小鼠免疫血清,中和抗体的最大值与最小值倍数差均小于4,中和抗体检测变异系数分别为6.38%和3.64%。结论 抗CV-A10中和抗体检测用毒株具有较好的专属性可很好的应用于后续抗CV-A10中和抗体的相关检测。     

肺炎链球菌ciaH/R基因重组表达及CiaH/R与β-内酰胺类耐药相关性

目的：构建肺炎链球菌ciaH和ciaR基因的原核表达系统，探讨ciaH和CiaR封闭后细菌耐药性变化。方法：采用PCR扩增全长ciaH和ciaR基因，以常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS—PAGE及Bio—Rad凝胶图象分析系统检测目的重组蛋白rCiaH和rCiaR表达量。制备rCiaH和rCiaR兔抗血清及其IgG。检测IgG胞外或胞内封闭肺炎链球菌菌株CiaH和CiaR后，细菌对青霉素和头孢噻肟耐药性的变化。结果：与报道序列比较，所克隆的ciaH和ciaR基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99．9％～100％和100%。所构建的工程菌E．coli BL21DE3^pET42A-ciaH和E．coli BL21DE3^pET42a-ciaR能高效表达目的重组蛋白rCiaH和rCiaR，其产量分别高达细菌总蛋白的33％和45％。rCiaH、rCiaR抗血清及其IgG免疫双扩散效价分别为1：4、1：4和1：1、1：1。CiaH—IgG胞外或胞内封闭CiaH、CiaR—IgG胞内封闭CiaR后，青霉素及头孢噻肟敏感菌株可出现对两种抗生素的耐药性，但对耐药菌株耐药性无明显影响。结论：成功地构建了肺炎链球菌ciaH／ciaR基因原核表达系统，为深入研究该TCS与耐药性关系奠定了基础。CiaH和CiaR均与肺炎链球菌对青霉素及头孢噻肟耐药性有关。     

二元信号系统ComD/ComE与肺炎链球菌对β-内酰胺类抗生素耐药的相关性

目的 构建肺炎链球菌comD基因敲除突变株,了解comD基因与细菌β-内酰类抗生素耐药性的相关性,探讨氯氰碘柳胺下调comD、comE和comC基因mRNA的作用.方法 构建用于comD基因敲除的自杀质粒pEVP3comD,通过同源重组及插入失活获得肺炎链球菌ATCC6306株comD基因敲除突变株comD-.采用PCR及免疫荧光法对comD-突变株进行鉴定.采用实时荧光定量RT-PCR检测氯氰碘柳胺处理前后comD-突变株及野生株comD、comE和comC基因mRNA水平变化.采用二倍琼脂稀释法测定comD-突变株及野生株对青霉素G和头孢噻肟的敏感性.结果 测序及免疫荧光试验结果证实,所构建的comD-突变株染色体DNA中comD基因被插入失活.50μmol/L或100 μmol/L的氯氰碘柳胺能明显下调comD、comE和comC基因mRNA水平(P＜0.05),25μmol/L的氯氰碘柳胺则否.comD-突变株对青霉素及头孢噻肟最低抑菌浓度(MIC)值均为32μg/ml,明显高于野生株的0.06 μg/ml和1 μg/ml.结论 本研究成功地构建了肺炎链球菌comD基因敲除突变株.comD基因与细菌对β-内酰类抗生素耐药性密切相关.氯氰碘柳胺可通过下调comD、comE和comC基因的转录水平,从而对细菌感受态形成产生影响.     

小儿病毒性脑炎脑电图分析

目的:探讨脑电图对小儿病毒性脑炎早期诊断及预后评估的临床价值.方法:将脑电图结果与头颅CT结果进行比较,分析不同时期的临床诊治效果.结果:在86例病例中脑电图阳性率87.21%,CT阳性率32.56%,两组比较有显著性差异(P＜0.01).早期病例56例全部治愈,治愈率100%;中期病例20例,治愈率80%,好转4例;极期4例,好转2例,死亡2例.不同时期病例治愈率存在显著性差异.结论:脑电图对小儿病毒性脑炎的早期诊断及预后评估有重要临床价值.     

基于超快速气相电子鼻对不同产地枸杞子快速识别及气味差异物质研究

  目的  通过气味测定研究, 快速识别不同产地枸杞子及气味差异物质。  方法  收集甘肃、内蒙古、宁夏、新疆及青海等5个产地枸杞子, 利用超快速气相电子鼻对样品进行检测, 建立气味指纹图谱, 并利用AroChemBase数据库对13个共有气味峰进行指认。运用判别因子分析(Discriminant factor analysis, DFA)、卷积神经网络(Convolutional neural networks, CNN)判别模型、主成分分析(Principal component analysis, PCA)及偏最小二乘判别分析(Partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)对所得数据进行处理, 并通过变量权重重要性排序(Variable importance in projection, VIP)值作图筛选差异成分。  结果  不同产地枸杞子能区分开, 气味色谱峰峰8(己醛)、峰9(糠醛)为5个产地枸杞子样品间的主要差异成分, 己醛含量排序为: 内蒙古>甘肃>宁夏>新疆>青海; 糠醛含量排序为: 甘肃>新疆>宁夏>青海>内蒙古。  结论  超快速气相电子鼻可较好分析枸杞子气味特征, 并快速、准确识别差异物质, 为不同产地枸杞子的用药选择和综合利用提供参考。      

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 StxⅡ基因表达

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157∶H7StxⅡ基因表达,并评价其对细菌生长的影响及细胞毒性。方法针对EHEC O157∶H7StxⅡ基因设计引物,构建CRISPR/Cas9表达质粒pdCas9-StxⅡ并转化EHEC O157∶H7感受态细胞,采用RT-PCR及胶体金法检测StxⅡ基因表达情况,绘制菌株生长曲线,将菌株培养上清液接种Vero细胞观察细胞病变情况。结果测序分析显示pdCas9-StxⅡ表达质粒被成功构建;转化EHEC O157∶H7(00G097)感受态细胞后,StxⅡ基因mRNA、蛋白表达均受抑制,EHEC O157∶H7生长曲线未受影响(P值均0.05)。pdCas9-StxⅡ-00G097菌株培养上清液对细胞的毒性效应(CPE为30%)显著低于对照菌株00G097和pdCas9-00G097(CPE均80%)。结论成功构建的pdCas9-StxⅡ表达质粒能特异抑制EHEC O157∶H7StxⅡ基因表达、降低细胞毒性,为进一步研究志贺毒素StxⅡ在EHEC O157∶H7致病机理和基因工程减毒活菌苗奠定了基础。     

江苏省两地手足口病/疱疹性咽峡炎相关肠道病毒外环境调查

目的 调查儿童手足口病/疱疹性咽峡炎感染可能的外界环境原因，寻找肠道病毒在公共场所外环境存在和污染的证据，为优化防控工作提供依据。方法 在2个手足口病高发地市对医院、社区游乐区环境表面涂抹采样，检测肠道病毒，并对阳性标本进行测序。结果 医院环境肠道病毒总检出率为10.44%，其中独立接诊区域检出率47.50%，非独立接诊区10.37%，差异均有统计学意义；接诊区肠道病毒检出率较高的环境表面分别是护士分诊台（50.00%）、医生坐诊台（36.67%）、诊室门把手（30.00%）、候诊区地面（22.73%）、候诊椅（20.41%）、洗手设施（7.69%）等；三级医院的肠道病毒检出率最高（17.99%）；社区内公共游乐区检出率为1.08%，分别在滑滑梯扶手、滑滑梯表面和游乐区座椅表面检出。阳性标本进一步测序得到CVA16、CVA6、CVA10、CVB5 4个型别。结论 手足口病/疱疹性咽峡炎接诊医院和社区公共游乐场环境物品表面检出肠道病毒，在手足口病/疱疹性咽峡炎流行季节应加强环境消毒。社区是容易引起交叉感染的区域，应引起重视。     

肺炎链球菌comD/E/C基因重组表达及ComD/C与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性

目的:构建肺炎链球菌调控感受态形成的二元信号传导系统(TCS)基因comD/comE/comC的原核表达系统,探讨ComD和ComC封闭后细菌耐药性变化.方法:采用PCR扩增全长comD、comE和comC基因,并用常规基因工程技术建立其原核表达系统.采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图像分析系统检测目的重组蛋白rComD、rComE和rComC表达量.免疫家兔制备rComD、rComE和rComC抗血清.检测肺炎链球菌菌株ComD和ComC被抗血清封闭后对青霉素和头孢胺噻耐药性的变化.结果:与报道序列比较,所克隆的comD、comE和comC基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.4%～99.3%和99.1%～100%.所构建的工程菌E.coli BL21DE3pET42a-comD、E.coli BL21DE3pET42a-comE和E.coli BL21DE3pET32a-comC能有效表达目的重组蛋白rComD、rComE和rComC,其产量分别为细菌总蛋白的28%、25%和35%.rComD、rComE和rComC抗血清免疫双扩散效价分别为1∶4、1∶4和1∶8.ComD和/或ComC被抗血清封闭后,头孢胺噻敏感菌株可出现耐药性,但耐药菌株耐药性无明显改变,也不影响各菌株对青霉素的耐药性.结论:本研究成功地构建了肺炎链球菌comD/come/comC基因原核表达系统,为深入研究感受态形成相关TCS与耐药性关系奠定了基础.ComD和ComC与肺炎链球菌对头孢胺噻耐药性有关.