高糖对大鼠系膜细胞肝细胞生长因子受体表达的影响及其机制研究

目的 观察高糖作用下大鼠系膜细胞(MsC)肝细胞生长因子（HGF）受体c-Met的表达，并探讨其机制和意义。 方法 用RT-PCR和Western 印迹方法检测高糖作用大鼠MsC的不同时间点（0、12、24、48、96 h）c-Met的表达。分别用光辉霉素A（mithramycin A）和SU11274抑制转录因子Sp1的DNA结合活性和阻断c-Met。用电泳迁移率改变实验(EMSA)观察Sp1与c-Met基因启动子的结合活性。以荧光探剂二氯双氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)捕获细胞内活性氧。 结果 大鼠MsC的c-Met表达在高糖作用12、24和48 h都明显上升，96 h开始下降。光辉霉素A呈浓度依赖性抑制高糖作用下大鼠MsC的c-Met表达上调。大鼠MsC内Sp1与c-Met基因启动子的结合活性在高糖作用下明显增强。HGF及c-Met显著抑制高糖诱导的大鼠MsC内活性氧的增多。 结论 高糖作用下大鼠MsC的c-Met表达增强，其机制可能是通过Sp1介导。HGF-c-Met信号通路激活能抑制高糖所致大鼠MsC内的氧化应激反应。     

兔股动脉粥样硬化斑块模型中TF及TFPI的变化

目的： 观察兔股动脉粥样硬化斑块发展过程中斑块内组织因子（TF）及组织因子途经抑制物-1（TFPI-1）、组织因子途经抑制物-2（TFPI-2）的变化。方法： 新西兰雄兔通过高脂饲养合并股动脉球囊损伤建立动脉粥样硬化斑块模型。在建模8周、10周和12周，分别截取球囊损伤处股动脉标本，检测斑块组织内TF、TFPI-1和TFPI-2的蛋白表达；并测定斑块内TF、TFPI-1和TFPI-2的mRNA水平。结果： 自8周、10周到12周，血管斑块中TF、TFPI-1和TFPI-2的观测区域内阳性染色面积均逐渐增加。自8周、10周到12周，血管斑块中TF的mRNA水平和TFPI-1的mRNA水平均逐渐增加；TFPI-2mRNA表现为前期无明显变化，12周时显著下调。结论： 在兔股动脉粥样硬化斑块的形成过程中，随着斑块内TF基因及蛋白表达的增加,TFPI-1和TFPI-2反应性表达增加，但其表达水平未能完全抑制斑块的进展。     

基于单中心儿童样本库人群全外显子组数据的致病突变携带者分析

目的 通过对比公共数据库和复旦大学附属儿科医院分子诊断中心（复旦儿科）样本库全外显子组测序（WES）数据中已知儿童致病突变频率差异,推测中国人群隐性遗传致病基因携带者频率分布。方法 整理公共数据库（OMIM、ClinVar、HGMD）中常染色体隐性遗传病的致病基因和突变位点,计算复旦儿科样本库中的WES数据,基于公共数据库的致病基因的携带者频率。结果 从公共数据库分析中共得到1 368个常染色体隐性致病基因上的60 209个位点。在复旦儿科1 147例临床WES样本中,共筛出408个基因上的1 016个突变位点。比较复旦儿科、人类外显子组整合数据库（ExAC）东亚（4 312例）和欧洲人群（33 301例）突变位点的出现频率,3个人群中均发现了人群特有的突变位点,相比ExAC欧洲人群,复旦儿科人群中的突变位点出现频率与ExAC东亚人群更为相近。在携带者频率>1%的基因中,复旦儿科和ExAC东亚人群相同的基因分别为70/81个（86.4%）和70/102个（68.6%）;复旦儿科和ExAC欧洲人群相同的基因分别为37/81个（45.7%）和37/136个（27.2%）。结论 通过与ExAC东亚和欧洲人群数据进行对比,中国人群中隐性致病基因及致病突变位点的携带者频率与ExAC东亚人群较为相似,与欧洲人群差异较大,建立针对中国人群特异性的常见遗传携带者突变位点筛查项目十分必要。     

醛糖还原酶(AR)基因对大鼠肾系膜细胞的转染及AR抑制剂对其增殖的影响

目的观察醛糖还原酶(AR)基因转染及AR抑制剂(ARI)对体外培养大鼠肾系膜细胞(MsC)增殖的影响。方法应用Westernblot检测转基因MsC及PDGF作用MsC后AR的表达。四唑蓝比色法(MTT法)检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,对比大鼠正常MsC和转基因MsC的生长情况,并观察ARI———Sorbinil和Zopolrestat对血小板源性生长因子(PDGF)和小牛血清(NBS)促细胞增殖作用的影响。结果①Westernblot鉴定转基因MsCAR表达较正常MsC明显增高;②转染组较正常组生长速度快;③PDGF作用MsC后可上调AR的表达;④PDGF和10%NBS均可显著刺激两组细胞的增殖,ARI可部分抑制PDGF对正常组和转染组的促增殖作用,对10%NBS,ARI可部分抑制其对转染组的促增殖作用,而对正常组无显著影响,抑制作用呈剂量依赖性。结论AR可能参与了MsC在病理状况下的过度增殖过程。     

组织因子途径抑制剂治疗弥散性血管内凝血的研究进展

近年来．尽管监护和治疗水平日益完善．但败血症及其并发症的发病率仍在不断上升，是临床常见的死亡原因之一。弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation．DIC）作为常发生于败血症患者的并发症，其死亡率仍居高不下。DIC不是一种独立的疾病，而是某些临床已有明确诊断的疾病伴有的、以广泛血管内凝血和出血倾向为特征的中间发病环节和并发症。DIC发病原因、发病机制复杂。但发病过程中均有凝血功能的改变。在其发病机制中天然抗凝途径功能紊乱起着重要作用，因此就大多数DIC患者而言。抗凝治疗仍是阻断DIC病理过程的最重要措施之一。     

重组组织因子途径抑制物对大鼠肾系膜细胞凋亡及Fas和bcl-2表达的影响

目的 观察重组组织因子途径抑制物(rTFPI)对大鼠肾脏系膜细胞(MsC)凋亡的影响,并探讨其可能相关的凋亡机制.方法 免疫组织化学(ABC)法检测人肾穿组织中TFPI表达;免疫荧光法检测培养正常大鼠MsC中TFPI表达;将rTFPI及其不同结构域蛋白分别作用于大鼠MsC,Hoechst 33258染色观察MsC细胞核形态变化;流式细胞仪定量检测MsC细胞凋亡率;DNA片段凝胶电泳分析MsC凋亡情况;Western blot检测凋亡相关激酶半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、bel-2以及Fas蛋白的表达.结果 系膜增生型肾小球肾炎肾小球内TFPI表达高于轻微病变者;正常大鼠MsC中有TFPI表达;rTFPI及其C末端能诱导大鼠MsC发生凋亡,并具有剂量和时间依赖性劝口入rTFPI后,MsC的凋亡率分别为对照组的2.1、3.0及4.9倍(P<0.05).活性形式的caspase-3和Fas蛋白表达明显高于对照组,bcl-2表达无明显变化.结论 rTFPI能诱导正常大鼠MsC发生凋亡,并且其主要功能区位于C末端,死亡受体Fas/FasL信号通路可能参与了rTFPI诱导MsC凋亡的过程.     

智力发育迟缓新候选基因POSTN对脑损伤神经元体外保护作用研究

目的 通过对1例智力发育迟缓患儿全外显子组测序（WES）,旨在为该患儿寻找潜在的致病原因。方法 纳入1例在复旦大学附属儿科医院（我院）住院期间诊断不明患儿,采用SureSelct Human All Exon捕获试剂盒和Illumina HiSeq2000测序平台,行WES检测;数据分析采用我院分子诊断中心建立的高通量测序数据分析流程;结果采用Sanger直接测序法进行验证。建立体外大鼠神经元原代培养和糖氧剥夺（OGD）模型,分为空白对照组（Sham+PBS亚组、Sham+POSTN亚组）、OGD组（OGD+PBS亚组和OGD+POSTN亚组）,采用免疫荧光、LDH毒性检测、BrdU和TUNEL方法检测POSTN对2组及其亚组神经元生长增殖和凋亡的影响。结果 患儿WES共检测到532 151个变异,筛选后检测到POSTN基因（NM_006475）外显子23:c.A2475T:p.G825G和外显子19:c.G2251A:p.E751K。Sanger测序显示p.G825G来自母亲,p.E751K来自父亲,符合复合杂合遗传模式。培养的大鼠原代神经元（MAP-2或NeuN阳性细胞）中有内源性POSTN的表达。LDH活性Sham+POSTN亚组与Sham+PBS亚组差异无统计学意义,OGD+POSTN亚组与OGD+PBS亚组差异有统计学意义。OGD+PBS亚组致神经元细胞缺氧2、6、12 d后比Sham+PBS亚组BrdU阳性的神经元数量增高,TUNEL阳性神经元凋亡也增高;OGD+POSTN亚组各时间点神经元增殖较OGD+PBS亚组均明显增高,但凋亡减少。结论 POSTN可以减少脑损伤后LDH对于神经元的细胞毒性,促进损伤后神经元的增殖,抑制凋亡。