壳聚糖与神经干细胞生物相容性的研究

目的 探讨生物降解材料壳聚糖与神经干细胞的生物相容性。方法 取SD大鼠胚胎（孕14-16d)大脑皮层组织制成单细胞悬液在无血清培养液中进行培养，获得大量的神经干细胞，再将所获神经干细胞在不同条件下移植接种至壳聚糖膜上联合培养1周，在倒置显微镜下观察神经干细胞生长增殖情况及形态变化，并对其分别进行免疫组化染色，电镜观察，了解壳聚糖对神经干细胞生长，增殖，分化的影响。结果 在无血清联合培养条件下，神经干细胞仍然维持其原有的干细胞特性；在含血清的培养液中，神经干细胞能分化成多种形态的神经细胞，并且在壳聚糖膜上生长良好。结论 壳聚糖与神经干细胞具有良好的生物相容性。     

壳聚糖神经干细胞复合物修复大鼠完全性脊髓损伤的组织学观察

目的：探讨壳聚糖与神经干细胞复合物修复成年SD大鼠完全性脊髓损伤的可行性。方法：制作大鼠脊髓完全缺损模型，在形成的缺损中植入壳聚糖与神经干细胞复合物(实验组)，或只植入壳聚糖(对照组)，或不加任何材料(空白组)，术后2、4、8周灌注取材，观察结果。结果：壳聚糖与神经干细胞复合物在植入SD大鼠脊髓完全缺损模型后，能桥接缺损两端脊髓；其内的神经干细胞能存活、迁移并分化成多种形态的神经组织细胞，并诱导神经轴突向复合材料内生长。结论：壳聚糖与神经干细胞复合物有可能桥接并修复大鼠脊髓完全缺损性损伤。     

中药“神经再生素”促神经生长过程中基因差异性表达的初步研究

为了探索中药“神经再生素”促神经生长过程中基因水平的变化。本实验采用 dd-PCR方法 ,从体外培养背根神经节细胞加药组和不加药组中获得两者的差异表达片段 ,并经反杂交筛选、克隆测序、DNA序列检索分析、Northern验证。结果表明 ,差异显示共获得 8个差异条带 ,一个为下调基因 ,其余为上调基因 ,其中 2个 c DNA序列与 RRAJ5 16 1基因 (增殖相关基因 )、AF196 3 15基因 (锌指样蛋白 DDP2 ) 10 0 %同源 ,2个 c DNA序列与 AK0 0 175 7基因、STA5 SRR基因 (t RNA合成酶 )部分同源。结论是中药“神经再生素”在促神经生长过程中 ,对神经元基因的选择性表达起着重要的调控作用。     

人工组织神经移植物修复狗缺损坐骨神经后腓肠肌的形态观察

目的 了解复合型医用可降解材料制成的人工组织神经移植物辅加神经再生素修复狗坐骨神经缺损后，腓肠肌的形态变化。方法 将人工组织神经移植物连接在狗的坐骨神经缺损30mm处。以自体神经桥接和神经缺损的狗为对照组Ⅰ和Ⅱ。术后6个月时取腓肠肌进行称重、特殊染色和组织化学染色，显微镜下了解腓肠肌的形态变化并进行图像定量分析，同时了解肌纤维的超微结构变化。结果 术后6个月，实验组腓肠肌的萎缩形态指标变化均轻于对照组Ⅱ，而与对照组Ⅰ相似。结论 经人工组织神经移植物修复缺损的坐骨神经后，使腓肠肌又重新获得神经支配，肌肉萎缩明显减轻。     

雪旺细胞在局灶性脑损伤大鼠脑内的存活和迁移

目的 :了解雪旺细胞移植入局灶性脑损伤大鼠脑内后的存活、迁移情况。方法 :SD大鼠采用 Feeney's自由落体撞击法制成局灶性脑损伤模型。雪旺细胞以 Hoechst33342荧光素进行荧光标记 ,在大鼠损伤后即刻移植入脑损伤区。移植后 3天、7天、14天、2 8天、6 0天、90天处死大鼠 ,观察细胞标记荧光情况。结果 :3天、7天时移植的雪旺细胞大量存活于损伤区、海马、侧脑室的脉络丛组织中。 14天后可观察到细胞沿软脑膜、室管膜、血管周间隙迁移 ,并在胼胝体部位排列成索条状。 6 0天时雪旺细胞的标记荧光减弱 ,细胞密度减少。 90天时已观察不到荧光。并在雪旺细胞存活区有巨噬细胞浸润。结论 :雪旺细胞移植入大鼠脑损伤区后可存活并沿特定部位迁移 ,可能由于血脑屏障破坏等因素 ,机体对其有免疫排斥反应     

大鼠失神经支配后比目鱼肌和趾长伸肌超微结构变化的实验研究

目的:探讨比目鱼肌和趾长伸肌失神经支配后不同时间点超微结构变化。方法:建立SD大鼠坐骨神经离断模型,分别于术后1,2,3,4周电镜下观察大鼠比目鱼肌和趾长伸肌的超微结构变化。结果:失神经支配1周,比目鱼肌纤维局部萎缩变细,肌丝排列不规则,部分线粒体出现肿胀;趾长伸肌的肌丝排列稍不规则,线粒体形态等无明显异常。失神经支配2周比目鱼肌萎缩变细加重,肌节与肌丝排列紊乱,部分线粒体空泡变性;趾长伸肌的肌丝局部萎缩变细,肌间隙增宽,线粒体发生轻微肿胀。失神经支配后3、4周,比目鱼肌肌节肌丝变化明显,结构模糊不清,线粒体呈空泡化;趾长伸肌的肌丝排列不规则,肌原纤维结构可辨,线粒体肿胀明显,部分出现空泡化。结论:周围神经损伤可致骨骼肌超微结构发生明显变化,并随着失神经支配时间延长而逐渐加重;比目鱼肌失神经支配后超微结构的变化较趾长伸肌明显。     

坐骨神经横断伤后远侧段组织的形态学及相关因子表达变化

目的:通过制备GFP小鼠和B6小鼠坐骨神经横断伤模型,应用免疫组化技术以及RealTime-PCR技术观察和分析周围神经损伤后远侧段组织的形态学及相关因子表达变化。方法:制备GFP小鼠坐骨神经横断伤模型,应用免疫组化技术分别染色S100蛋白以显示施万细胞,染色NF蛋白以显示轴突;结合GFP小鼠的自发荧光以及Hoechst核染观察横断伤后不同时间点远侧段组织的形态学变化。制备B6小鼠坐骨神经横断伤模型,应用RealTime-PCR技术检测横断伤后远侧段组织中相关营养因子BDNF、NGF、CNTF及抗凋亡因子Bcl-2 mRNA的表达变化。结果:坐骨神经横断伤后,远侧段施万细胞S100蛋白的表达第7天时达到高峰,第14天时下降,形成狭长细胞索带;第21～28天时仅少数细胞S100蛋白阳性。远侧段NF免疫组化产物于横断伤后第7天时断裂呈碎片状,第28天时碎片亦基本消失不见。远侧段非特异核染数目随损伤时间延长而增加。同时,在远侧段整个溃变过程中,神经基膜管结构仍然可见。坐骨神经横断伤后,BDNF mRNA表达第1～3周内逐渐上调,其中第3周时达到高峰(P<0.01),第4周时下降到与正常值相比无统计学意义的水平。NGF mRNA表达第1周时达到高峰(P<0.01),第2周时比第1周有小幅下降,但仍然具有统计学意义(P<0.01),第二周以后下降到与正常值相似的水平。CNTF mRNA表达则在损伤后第1周时下降了35%,第2周时继续下降到正常水平的42.7%,其下降均具有统计学意义(P<0.01),第3周时有所回升,第4周时下降到低点。Bcl-2 mRNA表达在损伤后第1周时下降,第2、3周时上升,第3周时达到高峰,并且上升具有统计学意义(P<0.01)。结论:坐骨神经横断伤后4周,远侧段神经组织中神经基膜管结构仍然存在。神经营养因子BDNF、NGF、CNTF mRNA的表达时相不同,提示其表达调控机制不同。Bcl-2 mRNA表达变化与施万细胞凋亡相关。     

Tropicl808基因表达蛋白的免疫组织化学研究

目的：制备Tropicl808基因重组蛋白的单克隆抗体，对其表达蛋白在损伤大鼠坐骨神经中的表达与分布进行研究。方法：用Tropicl808基因重组蛋白作为抗原免疫BALB／C小鼠，有限稀释法获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，取切断12天后的SD大鼠坐骨神经的近侧端和远侧端．利用Tropicl808基因重组蛋白单抗进行免疫组织化学染色。结果：获得2株识别Tropicl808基因重组蛋白的单克隆抗体的细胞株Ⅱ4B、Ⅲ4C。ELISA法测定杂交瘤细胞培养上清及体内成瘤后产生的腹水抗体效价分别为l：80、l：104；杂交瘤细胞染色体数平均为90～102；亚类鉴定单抗的重链为小鼠IgGl。轻链为k型。损伤神经的近侧端和远侧端施万细胞均有Tropicl808基因表达蛋白的表达，远侧端的强度和面积强于和大于近侧端。结论：成功制备了Tropicl808基因重组蛋白的单克隆抗体。并提示该蛋白在神经再生中有一定作用。     

识别脊神经感觉神经元单克隆抗体的制备

将脊神经感觉神经元特有的蛋白组份作为抗原,注入BABL/c小鼠腹腔中。采集经免疫的小鼠脾细胞,以聚乙二醇(PEG)为促融剂,使之与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。应用HAT选择性培养液培养杂交瘤细胞。三周后,以ABC法检测,筛选出仅对感觉神经元起反应的Ⅱ6H杂交瘤细胞株,三次有限稀释,克隆化后,体外培养达一年之久,仍能稳定地分泌抗体。该抗体属IgG_1亚类,特异性地识别感觉神经元特有的蛋白组份。应用该单抗,可鉴别周围神经干中的感觉与运动纤维,亦可研究感觉神经的发育以及结构与功能的关系。     

识别人脊神经感觉特异蛋白单克隆抗体的制备及临床应用

观察快速免疫染色法鉴别人周围神经束性质的临床应用可行性。从新鲜人尸脊神经后根中分离、提取了脊神经节感觉神经元特异蛋白，将该蛋白作为抗原以杂交瘤技术制备了识别感觉神经元特异蛋白的单克隆抗体。用食用亮蓝标记该单抗后，直接为临床６例周围神经损伤患者术中染色。经３０分钟能清晰分辨出感觉及运动束，取得了预期效果。采用此技术染色步骤简单，能在肉眼和手术显微镜下观察，对周围神经断伤能够快速、准确、特异性的鉴别出功能神经束，提高了手术效果