microRNA与肿瘤发生的关系及在临床诊治中应用

microRNA(miRNA)是一类内源性非编码小分子RNA,通过阻遏mRNA的翻译来调控基因的表达,大量研究证明其与肿瘤的发生密切相关.该文将重点论述调控肿瘤发生、发展的miRNA,详细阐述这些短片段RNA在肿瘤的分子诊断及临床个体性治疗中的应用.     

临床样本DNA自动测序结果的判读

自动测序技术向临床医学方向转化,使测序结果电泳图的正确判读成为临床分子病理学家、肿瘤学家及临床研究者十分重要的技能之一。本文总结了自动测序结果图中单位点杂峰、杂合子、纯合子及长片段杂峰序列,以及缺失与插入所致框移等的特点和正确判读方法,并就其发生原理、注意事项及处理方法等作一探讨。另外,结合临床实践对ＤＮＡ测序的报告内容提出了相应的要求。     

胃癌石蜡包埋组织的miRNA实时荧光定量PCR表达

目的：研究miRNA在胃癌石蜡包埋组织和新鲜组织的表达。方法：应用实时荧光定量PCR检测6例石蜡包埋胃癌组织及其正常胃黏膜组织、新鲜胃癌组织及其正常黏膜组织的miRNA表达（let-7a,miR-21,miR-155）,以U-6为内参对照。结果：胃癌石蜡包埋组织与胃癌新鲜组织中miRNA表达呈平行性高表达。结论：可以利用石蜡组织进行miRNA相关指标表达研究。     

非小细胞肺癌组织中EGFR基因突变与ERCC1基因表达的关系

目的观察非小细胞肺癌(NSCLC)组织中表皮生长因子受体(EGFR)基因突变与切割修复交叉互补基因1(ERCC1)表达的关系。方法收集103例NSCLC组织腊块,用实时荧光定量PCR检测ERCC1 mRNA,用直接测序法检测EGFR基因。结果 103例中EGFR突变27例,未突变76例。27例EGFR突变型中,ERCC1基因高表达10例,低表达17例;76例EGFR野生型中,ERCC1基因高表达42例,低表达34例。Mann-Whitney u检验结果显示P>0.05。结论 NSCLC组织中EGFR基因突变状态与ERCC1的表达水平无相关性。     

MPN患者JAK2基因V617F点突变的检测及意义

目的探讨JAK2基因V617F点突变在骨髓增殖性肿瘤（MPN）中的发生情况及其意义。方法本组受检者共100例。MPN患者82例,其中真性红细胞增多症（PV）20例,有红细胞增多但未能诊断为PV者10例,原发性血小板增多症（ET）14例,有血小板增多但未能诊断为ET者13例,原发性骨髓纤维化（PMF）9例,慢性髓性白血病（CML）2例,其他MPN 6例,其他不明原因白细胞升高患者8例;另有急性白血病（AML）1例,骨髓增生异常综合征（MDS）10例、腔隙性梗死3例,慢性肾炎1例,大B细胞性淋巴瘤1例,异体胎肝移植患者1例,正常体检者1例。提取100例受检者外周血液及骨髓样本中有核细胞DNA,采用直接测序法进行JAK2第12、14外显子突变热点的检测。结果 100例样本中,有52例检测了第12、14两个外显子,48例仅检测第14外显子。未发现第12外显子突变。V617F及其他突变总检出率为38%（38/100）。PV、ET、PMF、CML、其他MPN、其他不明原因白细胞升高患者中均检测到不同比例的JAK2基因V617F点突变;而18例非MPN患者样本中均未发现V617F点突变,两组相比,P〈0.01。结论 JAK2基因突变在MPN的发生率高于其他血液疾病,可作为诊断MPN的一项重要参考指标。     

APC基因MCR区突变与大肠肿瘤患者临床发病的关系

目的:探讨APC基因的第15外显子MCR区(mutation cluster region)的1493, 1367和1328位突变与大肠肿瘤患者(阳性家族史)临床发病的关系.方法:共提取65例标本的基因组DNA, 包括21例肠腺瘤标本组和16例肠腺癌标本组, 20例家族史阳性组和8例无家族史组. PCR特异性扩增APC基因的第15外显子MCR区, 经ABI3100基因测序仪测序, 对密码子突变情况按4个标本分组和基因变异类型进行统计分析.结果:检出APC基因的三种密码子突变, 即密码子1493(ACG>ACA), 突变的发生率为91.3%(63/69), 密码子1367(CAG>TAG),1.4%(1/69)和密码子1328(CAG>TAG)7.2%(5/69). 共检出4种碱基变化, 4478 (G→A), 4478 (G/A), 4096 (C/T)and 3979(C/T). 4478位碱基G→A和4478位碱基G/A分别在腺瘤组与无家族史组的比较有显著性差异( P<0.05),4478位碱基G→A在家族史阳性组与无家族史组的比较也有显著性差异( P<0.05). 基于临床病理突变表型, 四种核苷酸变化间经χ2检验比较发现有显著性差异( P<0.05)的是:4478位→A型突变分别与4478位G/A型突变、4096位C/T型突变和3979位C/T型突变之间, 4478位碱基G/A型突变分别与4096位C/T型突变和3979位C/T型突变之间, 而4096位C/T型突变和3979位C/T型突变比较无显著性意义.结论:密码子1493(ACG>ACA)的4478位(G→A)突变为各组最高频发的同义突变,与阳性家族史和腺瘤表型有关. 密码子1367(CAG>TAG)和1328(CAG>TAG)仅为腺癌表型的体细胞无义突变.     

尿路及胸腹水癌细胞基因检测

目的在形态学基础上开展更加灵敏准确的体液肿瘤细胞基因变异临床应用转化项目。方法常规形态学诊断后,应用多重荧光PCR、基因测序和FISH法分别检测尿液细胞DNA微卫星的不稳定性(microsatellite instability,MSI)和缺失、胸/腹水癌细胞表皮生长因子受体(EGFR)基因突变。结果29例尿液样本中的10例泌尿系肿瘤患者有4个低度MSI,5个高度MSI,1例为正常,1例膀胱癌尿液发现P16缺失/CSP17三体;诊断阳性敏感度达90%。而7例膀胱癌术后尿液复查患者,9例泌尿系统炎症,血尿和膀胱异型增生患者及3例正常体检者中仅发现一例微卫星不稳定现象,阴性特异性达95%。30例肺癌患者的胸/腹水细胞中有3例分别检测出EGFR基因第19外显子746-750del缺失1例,752-759del缺失1例,18外显子281del缺失1例及c-kit基因第11外显子558-565del缺失1例。结论应用多重PCR,FISH和基因测序法检测体液肿瘤细胞的基因突变缺失及DNA微卫星的不稳定性,可早期确诊和提高体液癌细胞阳性率(90%),细胞HE染色后也可进行微卫星和基因测序检测,适于晚期肿瘤胸腹水和膀胱癌治疗后复查,是无创性的诊断高度敏感特异的分子病理临床应用新项目。     

尿路及胸腹水癌细胞基因检测

目的 在形态学基础上开展更加灵敏准确的体液肿瘤细胞基因变异临床应用转化项目。方法常规形态学诊断后，应用多重荧光PCR、基因测序和FISH法分别检测尿液细胞DNA微卫星的不稳定性（microsatellite instability．MSI）和缺失、胸／腹水癌细胞表皮生长因子受体（EGFR）基因突变。结果29例尿液样本中的10例泌尿系肿瘤患者有4个低度MSI，5个高度MSI，1例为正常，1例膀胱癌尿液发现P16缺失／CSP17三体；诊断阳性敏感度达90％。而7例膀胱癌术后尿液复查患者，9例泌尿系统炎症，血尿和膀胱异型增生患者及3例正常体检者中仅发现一例微卫星不稳定现象，阴性特异性达95％。30例肺癌患者的胸／腹水细胞中有3例分别检测出EGFR基因第19外显子746—750del缺失1例，752—759del缺失1例，18外显子281del缺失1例及c—kit基因第11外显子558—565del缺失1例。结论应用多重PCR，FISH和基因测序法检测体液肿瘤细胞的基因突变缺失及DNA微卫星的不稳定性，可早期确诊和提高体液癌细胞阳性率（90％），细胞HE染色后也可进行微卫星和基因测序检测，适于晚期肿瘤胸腹水和膀胱癌治疗后复查，是无创性的诊断高度敏感特异的分子病理临床应用新项目。     

直接测序法检测结肠癌K-ras基因的灵敏度确认及评估

目的探讨直接测序法检测K-ras基因的灵敏度及可行性。方法用已知K-ras基因突变型及野生型细胞株DNA按比例混合,用直接测序法检测K-ras基因突变情况,对实验敏感度进行评估。结果正反向测序结果均显示,含突变型K-ras基因DNA 5%的5个复孔中,均未能明确检出突变,而含突变型基因DNA≥10%的所有样本及其复孔都检测出了突变;突变型的基因碱基T峰与野生型的对应碱基G峰的比例,各组间有明显差异（P均〈0.05）,且峰高随突变型DNA的质量浓度增加而增加,二者存在明确相关性（相关系数r=-1.00,相伴概率〈0.05）。结论直接测序法检测突变型DNA,当敏感度为10%时,特异性达到100%,且电泳图上突变峰与野生峰的高低比例可对细胞比例进行半定量评估,可以满足临床检测与研究。