反义血管内皮生长因子对乳腺癌细胞生长的抑制作用

目的　构建表达反义血管内皮生长因子165(VEGF165)的真核表达载体,观察其对人乳腺癌细胞MCF- 7的影响,探讨反义基因治疗乳腺癌的可行性。方法　应用基因重组技术,将人VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3真核表达载体中,构建VEGF165反义基因的真核表达载体,将此表达载体转染人乳腺癌细胞MCF -7,观察转染前后MCF 7的VEGF165表达及细胞生长周期。结果　成功构建出VEGF165反义RNA真核表达载体,反义质粒转染后MCF -7细胞VEGF165表达下降,G1期细胞增加,S期细胞减少,细胞增殖能力降低。结论　VEGF165反义RNA能够明显减少人乳腺癌细胞株MCF- 7内VEGF165的表达,抑制乳腺癌细胞的增殖,证明了反义基因干预治疗的有效性,为乳腺癌的基因治疗进行了有益探索。     

基于淀粉酶糖化力检测的麦芽药材质量控制

目的:建立麦芽药材糖化力检测方法,更有效地对麦芽药材进行质量控制。方法:采用间接碘量法,以糖化力为指标,单因素考察粉碎粒径、提取时间、提取温度、提取次数及溶媒倍数,并采用L9(34)正交试验优化麦芽提取方法。结果:确定最佳的提取方法为1.0 g麦芽粉末(过3号筛)加100 m L水,30℃浸渍1 h。该方法精密度和重复性RSD%分别为1.33%和1.35%,以9批麦芽药材对该方法进一步验证。结论:所得麦芽提取方法操作简便稳定,精密度和重复性均良好,说明该方法稳定可靠,可用于麦芽的质量控制。     

人肝细胞癌抗原HCA661 DNA疫苗的构建

目的：构建人肝细胞癌特异性抗原HCA661的DNA疫苗。方法：通过PCR从SMMC7721中获得编码肝细胞癌特异抗原HCA661的基因组DNA序列,插入pGEM-T easy载体后测序,并将目的基因定向亚克隆进入真核表达载体pCI-neo,以PCR和酶切方法鉴定构建的重组真核表达质粒pCI-neo-HCA661。结果：PCR产物为 1 040 bp,测序结果与Gene Bank登记完全相同;PCR和酶切结果表明,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的目的基因片段。结论：成功地构建了含有HCA661基因的DNA疫苗。     

流式细胞术检测CIK的免疫表型和体外杀伤活性

目的：探讨细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer,CIK）的免疫表型和体外杀伤活性。 方法:从健康人外周血分离淋巴细胞,经过IFNγ、CD3McAb、IL-2诱导并培养,获得大量的CIK。采用流式细胞术检测CIK的表型;以CFSE标记靶细胞来区分效应细胞,再以ＰＩ染色,用FACS检测靶细胞的死亡率。 结果:CIK于第22天达到增殖高峰,并高度表达CD3、CD11a、CD54和HLA-DR;中度表达CD3/CD56、CD25、CD28、CD69和FasL;CD16表达不增加。CIK对肿瘤细胞K562、 HL-60、Hela、SMMC7721和A375均表现出杀伤活性,其中对K562、HL-60、Hela 3种细胞的杀伤作用较强;而对SMMC7721、A375的作用不明显。 结论:细胞因子IFNγ、CD3McAb和IL-2体外诱导的单个核细胞具有强大的增殖力和杀伤活性。     

虎眼万年青多糖对小鼠T细胞及其细胞因子IL-2 mRNA表达的影响

目的：探讨天然产物虎眼万年青多糖（S₃）对T细胞及其细胞因子IL-2 mRNA表达的影响,进一步从细胞和分子水平探讨其免疫调节作用机制,为开发这一天然产物提供理论依据。 方法：利用流式细胞术,检测S₃对T淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8、CD4/CD8阳性细胞百分率的影响,并采用RT-PCR方法检测IL-2 mRNA的表达水平。 结果：各剂量组CD3、CD4阳性细胞百分率均有上升趋势,极高剂量组CD3、CD4与对照组比较差异有显著性（P<0.001）,CD8有下降趋势,各剂量组均能显著提高CD4/CD8阳性细胞百分率（P<0.001）;极高剂量组和高剂量组可明显促进脾细胞中细胞因子IL-2的mRNA表达,使表达量增加（P<0.01,P<0.05）。 结论：S₃具有较强的增强机体多种免疫功能的作用。     

人肌红蛋白原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的：构建人肌红蛋白（Mb）原核表达载体并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白pQE。方法：根据已报道的人Mb基因序列,采用RT-PCR技术从人骨骼肌组织中获得肌红蛋白cDNA序列。将所得的PCR产物插入克隆载体pGEM-Teasy中,得重组质粒,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将酶切目的片段插入原核表达载体pQpQEE30中并转化大肠杆菌(E.coli)M15,通过IPTG诱 导表达出带有6个组氨酸的融合蛋白。经镍固定金属亲和层析纯化。结果：序列分析表明,人Mb基因成熟肽编码区含有465 bp,编码153个氨基酸;与GenBank(NM203378) 中已报道的Mb核苷酸序列有98.50 %同源性。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE 电泳和免疫印迹分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的31%,相对分子质量约为16 700,并与商品化的人Mb单抗呈特异性反应。经Ni²⁺-NTA agarose 纯化获得SDS-PAGE 电泳下单一条带。结论：在大肠杆菌中获得了人Mb的高效表达。     

维生素B1治疗婴幼儿腹泻临床观察

目的　为了缩短婴幼儿腹泻病程，提高治愈率，防止因腹泻迁延不愈导致水、电解质紊乱，减少并发症的发生。方法　对５４ 例婴幼儿腹泻患儿肌注维生素 Ｂ１（ Ｖ Ｂ１） 治疗，并与４２ 例常规用抗生素、抗病毒及保护肠粘膜药物治疗进行对比。结果肌注 Ｖ Ｂ１ 组病程明显缩短，较对照组显著降低。结论　肌注 Ｖ Ｂ１ 治疗组疗效快，治愈率达９６ ．３ ％ ，是安全、经济、简便方法。     

解偶联蛋白嵌合体及突变体的构建方法

目的：构建解偶联蛋白(UCPs) 嵌合体和突变体,为阐明解偶联蛋白家族功能结构域的研究提供条件。方法：采用普通PCR和重叠延伸PCR获得UCPs 嵌合体基因片段,分别插入pCR2.1测序载体后进行测序,再以限制性内切酶连接方式将嵌合基因定向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1中,获得pcDNAUCP1UCP2、pcDNAUCP2UCP1和pcDNAUCP3UCP1,以PCR和酶切方法鉴定构建的重组真核表达质粒pcDNA。利用定向点突变产生pcDNA-UCP3R167G/pcDN
A- UCP3RE171/172GG,并进行测序证实。结果：PCR和酶切,获得的目的基因与嵌合基因片段中包含的碱基数量吻合;测序结果,UCPs嵌合体基因序列、突变体基因序列与预期设计完全相同。结论：成功地构建了含有UCPs 嵌合体和突变体基因重组真核表达质粒。
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DEAE—Sepharose阴离子交换柱一步纯化重组人IL—6

目的为了制备高纯度、高活性的重组人白细胞介素-6.方法化学诱导重组表达载体pT7.7hIL-6进行蛋白表达,菌体经超声破碎分离包涵体,并对包涵体进行洗涤、变性和复性处理,用DEAE-SepharoseCL-6B弱阴离子交换柱一步纯化复性的重组人IL-6.采用3H-TdR法测定rhIL-6的活性.结果表达产物经纯化后纯度达95%,比活性为3.0×108U/mg.结论本实验设计的纯化工艺简便易行,所得产品纯度高、产率高.