趋化因子受体7基因绿色荧光慢病毒载体构建及在未成熟树突状细胞中的表达

背景:趋化因子受体7(chemokine receptor-7,CCR7)是树突状细胞从外周迁移至淋巴系统发挥作用的最重要的启动和调节者,但未成熟树突状细胞表面不表达CCR7,因此利用携带CCR7基因的未成熟树突状细胞可以更好地诱导免疫耐受。目的:构建携带小鼠CCR7基因的绿色荧光蛋白重组慢病毒载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。方法:采用RT-PCR扩增小鼠CCR7基因并克隆至pCR-Blunt载体。将CCR7DNA片段及IRES-GFP连入慢病毒转移质粒LV-Lac,生成重组慢病毒质粒LV-CCR7。采用脂质体转染法将慢病毒系统3质粒(重组慢病毒质粒LV-CCR7、包装质粒ΔNRF及包膜质粒pVSVG)共转染包装慢病毒,重组慢病毒感染未成熟树突状细胞,光学显微镜观察细胞状态,流式细胞术鉴定CCR7蛋白的表达。结果与结论:实验成功扩增出小鼠CCR7DNA片段并克隆至pCR-Blunt载体,亚克隆构建慢病毒表达载体LV-CCR7,经3质粒包装系统感染293FT细胞后,24h于荧光显微镜下均观察到绿色荧光蛋白阳性表达,病毒滴度为108U/L以上,获得携带CCR7基因的重组慢病毒。慢病毒颗粒可有效感染未成熟树突状细胞,荧光显微镜可见大量GFP蛋白表达,阳性细胞达50%,流式细胞术检测到CCR7蛋白表达,LV-CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞仍保持在未成熟状态。结果证实,实验成功构建携带小鼠CCR7基因绿色荧光慢病毒载体LV-CCR7,并可在未成熟树突状细胞细胞中表达。     

趋化因子受体7基因绿色荧光慢病毒载体构建及在未成熟树突状细胞中的表达

背景：趋化因子受体7（chemokine receptor-7,CCR7）是树突状细胞从外周迁移至淋巴系统发挥作用的最重要的启动和调节者,但未成熟树突状细胞表面不表达CCR7,因此利用携带CCR7基因的未成熟树突状细胞可以更好地诱导免疫耐受。目的：构建携带小鼠CCR7基因的绿色荧光蛋白重组慢病毒载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。方法：采用RT-PCR扩增小鼠CCR7基因并克隆至pCR-Blunt载体。将CCR7DNA片段及IRES-GFP连入慢病毒转移质粒LV-Lac,生成重组慢病毒质粒LV-CCR7。采用脂质体转染法将慢病毒系统3质粒（重组慢病毒质粒LV-CCR7、包装质粒ΔNRF及包膜质粒pVSVG）共转染包装慢病毒,重组慢病毒感染未成熟树突状细胞,光学显微镜观察细胞状态,流式细胞术鉴定CCR7蛋白的表达。结果与结论：实验成功扩增出小鼠CCR7DNA片段并克隆至pCR-Blunt载体,亚克隆构建慢病毒表达载体LV-CCR7,经3质粒包装系统感染293FT细胞后,24h于荧光显微镜下均观察到绿色荧光蛋白阳性表达,病毒滴度为108U/L以上,获得携带CCR7基因的重组慢病毒。慢病毒颗粒可有效感染未成熟树突状细胞,荧光显微镜可见大量GFP蛋白表达,阳性细胞达50%,流式细胞术检测到CCR7蛋白表达,LV-CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞仍保持在未成熟状态。结果证实,实验成功构建携带小鼠CCR7基因绿色荧光慢病毒载体LV-CCR7,并可在未成熟树突状细胞细胞中表达。     

趋化因子受体7基因绿色荧光慢病毒载体构建及在未成熟树突状细胞中的表达**

背景：趋化因子受体7(chemokine receptor-7, CCR7)是树突状细胞从外周迁移至淋巴系统发挥作用的最重要的启动和调节者,但未成熟树突状细胞表面不表达CCR7,因此利用携带CCR7基因的未成熟树突状细胞可以更好地诱导免疫耐受。 目的：构建携带小鼠CCR7基因的绿色荧光蛋白重组慢病毒载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。 方法：采用RT-PCR扩增小鼠CCR7基因并克隆至pCR-Blunt载体。将CCR7 DNA片段及IRES-GFP连入慢病毒转移质粒LV-Lac,生成重组慢病毒质粒LV-CCR7。采用脂质体转染法将慢病毒系统3质粒(重组慢病毒质粒LV-CCR7、包装质粒     ΔNRF及包膜质粒pVSVG)共转染包装慢病毒,重组慢病毒感染未成熟树突状细胞,光学显微镜观察细胞状态,流式细胞术鉴定CCR7蛋白的表达。 结果与结论：实验成功扩增出小鼠CCR7 DNA片段并克隆至pCR-Blunt载体,亚克隆构建慢病毒表达载体LV-CCR7,经3质粒包装系统感染293 FT细胞后,24 h于荧光显微镜下均观察到绿色荧光蛋白阳性表达,病毒滴度为108 U/L以上,获得携带CCR7基因的重组慢病毒。慢病毒颗粒可有效感染未成熟树突状细胞,荧光显微镜可见大量GFP蛋白表达,阳性细胞达50%,流式细胞术检测到CCR7蛋白表达,LV-CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞仍保持在未成熟状态。结果证实,实验成功构建携带小鼠CCR7基因绿色荧光慢病毒载体LV-CCR7,并可在未成熟树突状细胞细胞中表达。 关键词：趋化因子受体7;未成熟树突状细胞;慢病毒载体;真核表达;组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.01.029     

葛菊护肝片调节NF-κB和Bcl-2/Bax信号通路改善酒精所致的小鼠肝脏损伤

目的 探究葛菊护肝片对酒精性肝损伤小鼠肝脏的保护作用,并基于核转录因子-κB p65（NF-κB p65）和B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白/Bcl-2相关X蛋白（Bax）信号通路探讨其作用机制。方法 SPF级雄性ICR小鼠60只,按体质量随机分为正常组、模型组、复方益肝灵片组、葛菊护肝片低、中、高剂量组。葛菊护肝片低、中、高剂量组分别灌胃0.2、0.4、0.8 g·kg^-1葛菊护肝片;复方益肝灵片组灌胃剂量0.16 g·kg^-1的复方益肝灵片,连续28 d,每天给药1次;正常组及模型组灌胃等体积纯水。第29天除正常组外,其余各组小鼠灌胃53°白酒,灌胃2次,灌胃间隔6 h;第30天取材。苏木素-伊红（HE）染色观察肝组织病理改变;透射电镜观察肝细胞超微结构改变;酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测肝组织丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）、甘油三酯（TG）、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）含量;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肝组织NF-κB p65、磷酸化核因子抑制蛋白α（p-IκBα）、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果 与正常组比较,模型组血清ALT、AST含量显著升高（P<0.01）,肝组织MDA、TG含量显著升高（P<0.01）,GSH含量显著下降（P<0.01）,肝脏HE染色、油红O和电镜肝损伤评分显著升高（P<0.01）;肝组织NF-κB、p-IκBα、Bax蛋白表达量均明显升高（P<0.05,P<0.01）,Bcl-2蛋白表达量明显降低（P<0.05）。与模型组比较,葛菊护肝片低、中、高剂量组血清ALT、AST含量显著下降,肝组织MDA、TG含量显著下降,GSH含量显著增加（P<0.01）;葛菊护肝片中、高剂量组HE和电镜评分显著降低（P<0.01）;葛菊护肝片中、高剂量组小鼠肝组织NF-κB、p-IκBα、Bax蛋白表达量显著降低（P<0.01）,葛菊护肝片低、中、高剂量组Bcl-2蛋白表达量显著升高（P<0.01）。结论 葛菊护肝片对ALD小鼠肝脏有一定的保护作用,其机制可能是通过下调NF-κB信号通路减轻肝组织炎症,下调Bax蛋白表达,上调Bcl-2蛋白表达抑制肝细胞凋亡实现的。     

CLAE强烈化疗序贯异基因造血干细胞移植治疗复发难治急性白血病的疗效观察

目的：观察CLAE强烈化疗方案序贯异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)治疗复发难治急性白血病(relapsed/refractory acute leukemia, R/R AL)的疗效与安全性。方法：采用CLAE方案[克拉屈滨5 mg/(m²·d),d 1-5；阿糖胞苷1.5 g/(m²·d),d 1-5；依托泊苷100 mg/(m²·d),d 3-5]序贯allo-HSCT治疗3例R/R AL患者。3例患者在复发难治状态接受CLAE化疗后行骨髓穿刺判断骨髓增生程度，间歇3-5 d后，序贯allo-HSCT预处理方案[氟达拉滨30mg/(m²·d),d-7至d-3；白消安注射液0.8 mg/kg q6h,d-6至d-3或d-5至d-2。若骨髓增生低下，原始细胞小于10%，应用3 d白消安注射液；若骨髓增生活跃，原始细胞大于10%，应用4 d白消安注射液]，采用环孢素、麦考酚吗乙酯、短程甲氨蝶呤预防GVHD。3例患者移植后规律监测微小残留病与骨髓嵌合状态，并于移植后3个月应用去甲基化药物或达沙...     

miRNA-125b靶向p16促进套细胞淋巴瘤细胞增殖和侵袭的机制探讨

目的:探讨miRNA-125b抑制靶基因p16对套细胞淋巴瘤细胞增殖和侵袭能力的影响。方法:选择人源套细胞淋巴瘤细胞系JeKo-1作为实验对象。实验共分为五组:空白对照组（不转染）、miRNA-125b阴性对照组（转染miRNA-125b inhibitor-NC）、miRNA-125b抑制剂组（转染miRNA-125b inhibitor）、p16 siRNA阴性对照组（转染p16 siRNA-NC）、p16 siRNA组（转染p16 siRNA）。于转染后48 h收集细胞。采用RT-PCR法检测各组JeKo-1细胞miRNA-125b的表达水平;采用双荧光素酶靶标实验验证miRNA-125b与p16基因的靶向关系;采用Western Blot和RT-PCR法检测各组细胞p16基因的表达水平;采用MTS法检测各组细胞增殖水平;采用流式细胞术检测各组细胞周期分布;采用Transwell侵袭实验检测各组细胞侵袭能力。结果:与空白对照组、miRNA-125b inhibitor-NC组相比,miRNA-125b inhibitor组 miRNA-125b表达水平显著降低,而p16表达水平显著升高,细胞增殖受到抑制、JeKo-1细胞穿膜细胞数显著减少,细胞G0/G1期比例显著增加,而S期比例逐渐减少（P＜0.05）;与p16 siRNA-NC组相比,p16 siRNA组p16表达水平明显被抑制,细胞增殖能力及细胞侵袭能力均显著升高,细胞G0/G1期比例显著降低,而S期、G2/M期比例升高,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。双荧光素酶报告基因实验分析结果显示,miRNA-125b与p16基因3' UTR端存在互补结合位点,miRNA-125b和p16能够靶向结合,p16基因是miRNA-125b的靶基因。结论:miRNA-125b能够通过抑制靶基因p16促进套细胞淋巴瘤细胞的增殖和侵袭能力,可通过抑制miRNA-125b,促进p16基因的表达,使套细胞淋巴瘤细胞阻滞于G0/G1期,抑制其增殖转化。     

微移植巩固治疗对完全缓解后急性髓系白血病患者的疗效分析

目的:观察微移植在急性髓系白血病(AML)中的疗效与安全性。方法:回顾性分析2014年7月至2019年10月接受微移植作为巩固治疗的13例成人AML患者的临床资料,随访观察微移植治疗的不良反应与疗效。结果:13例微移植患者中有8例仍处于完全缓解状态,5例患者微移植后复发,其中1例再诱导缓解后行脐血微移植。目前13例均处于生存状态,中位总生存期为13个月,中位无复发生存期为12个月。13例患者均发生2-4级血液学不良反应;中性粒细胞中位恢复时间13(11-15)d,血小板中位恢复时间15(13-17)d。13例患者均未发生急慢性移植物抗宿主病;12例患者发生不同严重程度的感染,无严重脏器功能损伤。结论:HLA不相合外周血和脐血来源的干细胞微移植是巩固治疗AML的有效方案,尤其对于低中危、老年AML患者疗效较显著。     

地西他滨为主化疗方案联合微移植巩固治疗伴TP53突变骨髓增生异常综合征老年患者一例并文献复习

目的:探讨地西他滨为主的化疗方案联合微移植巩固治疗伴TP53突变骨髓增生异常综合征（MDS）老年患者的疗效及安全性。方法:回顾性分析南京医科大学附属淮安第一医院收治的1例接受地西他滨、中剂量阿糖胞苷联合微移植治疗的伴TP53突变老年MDS患者的临床资料,并进行文献复习。结果:患者3次巩固治疗期间耐受性良好,3次移植后中性粒细胞恢复时间分别为15、16、14 d,血小板恢复时间均为16 d,均未发生急、慢性移植物抗宿主病（GVHD）;粒细胞缺乏期合并感染,积极抗感染治疗后好转,无严重脏器损伤相关并发症发生。结论:地西他滨为主的化疗方案联合微移植治疗伴TP53突变的老年MDS患者安全、有效,值得进一步研究探讨。     

急性早幼粒细胞白血病缓解期并发粒细胞肉瘤一例并文献复习

目的 提高对急性早幼粒细胞白血病（APL）缓解期并发粒细胞肉瘤（GS）的认识.方法 对1例APL缓解期并发GS患者的临床资料进行分析,结合文献进行讨论.结果 患者肿块行病理检查示：淋巴造血系恶性肿瘤;免疫组织化学示：MPO＋＋＋,末端脱氧核苷酸载移酶（TDT）＋＋,CD117＋,Ki-67＋,CD34-,CD20-,CD3-;荧光原位杂交（FISH）检测PML-RARα融合基因阳性,予以维甲酸及亚砷酸联合治疗后肿块消失.结论 APL缓解期出现肿块的患者应警惕GS的可能,必要时需行肿块病理、免疫组织化学或FISH检测,以避免因检查不足而延误诊断及治疗.     

伴ETV6-ABL1融合基因重排和RUNX1突变的骨髓增殖性肿瘤1例并文献复习

目的 探讨伴ETV6-ABL1融合基因重排和Runt相关的转录因子1(RUNX1)突变骨髓增殖性肿瘤(MPN)患者的临床特征、治疗及预后。方法 回顾性分析该院收治的1例同时伴有ETV6-ABL1融合基因重排和RUNX1突变的MPN患者临床资料,应用常规细胞遗传学方法、多重巢式逆转录PCR(RT-multiplex nested PCR)进行遗传学分析;高通量测序技术、血液肿瘤全外显子检测基因突变,并以“ETV6-ABL1”“myeloproliferative neoplasm”“RUNX1 mutation”为检索词,检索PubMed数据库进行文献复习。结果 患者为中年男性,临床表现主要为腹胀不适;体格检查显示巨脾;外周血白细胞明显升高,嗜酸性粒细胞增多;骨髓穿刺及活检显示骨髓增生活跃,嗜酸性粒细胞比例增高;染色体核型分析为46,XY,t (9;12)(q34;p13)[14]/46,XY[6];RT-multiplex nested PCR筛查显示ETV6-ABL1融合基因阳性;基因检测提示RUNX1 c720＿733del(p.his242 AlafsTer14,NM＿00175...