运用改良的捕获ELISA法检测流行性出血热特异IgM抗体

本文建立了用于流行性出血热早期诊断的 IgM 捕获 ELISA 法,并通过用葡萄糖氧化酶和葡萄糖代替 H_2O_2,改良了底物反应,提高了反应的敏感性和特异性。用该方法检测临床出血热病人血清,其双份血清 IgM 检出率可达100％,发病3日内和4～10病日的单份血清检测也具有高敏感性。同时对大量正常人血清及其他病人血清的检测未发现交叉反应,说明该方法的高特异性。由于底物系统的改良,使其具有显色明显的特点,适应干无酶标仪地区用目测法诊断。     

SARS-CoV蚀斑形成技术的建立

自2002年11月我国出现第一例传染性非典型肺炎(SARS)病例以来，至2003年8月已造成5000多例临床病例，其中死亡300多例，对我国国民经济和社会稳定造成了巨大影响。现在已确定了SARS-冠状病毒(SARS-CoV)为其病原体，也成功分离到多株SARS-CoV，并能在Veto细胞和2BS等细胞系中培养增殖，这为我们研发疫苗和研究病原学等方面提供了基础和基本条件。由于蚀斑试验和蚀斑减少中和试验用于测定病毒滴度和中和抗体效价的检测较其他方法准确，且特异性高，因此，用蚀斑方法可以准确测定病毒滴度、SARS患者恢复期抗体水平、疫苗免疫后的抗体产生水平以及评价疫苗的质量和有效性、抗病毒药物的筛选等。     

原代沙鼠肾细胞流行性出血热双价疫苗临床观察与免疫学效果研究

目的对新近研制成功的沙鼠肾原代细胞培养的流行性出血热双价疫苗（汉滩型＋汉城型）进行Ⅱ期临床扩大观察，考核其对人体的安全性和中和抗体反应。方法将观察人群设在不同地区，分别选择中国南方和北方两个点，每个点接种５００人的双价疫苗，同时接种２５０人的商品化单价疫苗（汉滩型）作对照，观察接种对象的副反应程度和采集其血清样品测定荧光抗体和以蚀斑减少中和法测定中和抗体，考核疫苗效果。结果观察结果显示，在观察的２８０人中分别有７人呈现轻度局部副反应和３７．５℃以下低热的全身反应，总反应率分别为２．５％。ＩＦＡ抗体阳转率１００％，ＧＭＴ１∶６７。中和抗体阳转率汉滩型为８７．６％，汉城型为９６．３％（ｎ＝８１）。如果以同一份血清中任何单一血清型阳转来计算，阳转率为１００％。以同一份血清两个血清型均需阳转来计算，则阳转率为７５．３％（６１／８１）。结论经过Ⅱ期临床人体观察结果显示，该双价疫苗仅有轻度局部反应和良好的中和抗体应答。证明该疫苗对人体安全，具有较好的免疫原性     

肾综合征出血热双价纯化疫苗的研制

目的: 研制肾综合征出血热双价纯化疫苗。方法:肾综合征出血热病毒I型LR1 株和II型R22株分别在Vero细胞上接种培养。I、II型病毒培养液依次经β 丙内酯灭活、超滤浓缩、蔗糖区带离心纯化及层析脱糖等处理。将检定合格的I、II型单价病毒原液等量混合后, 用AI(OH)3 佐剂吸附,制备 3批双价纯化疫苗。结果: 该 3批疫苗已经自检和中国药品生物制品检定所复检合格, 并已进行临床试验。结论: 采用Vero细胞培养制备肾综合征出血热双价纯化疫苗方法可行。     

SARS灭活疫苗毒种特性和效力试验方法的研究和建立

目的 验证SARS灭活疫苗生产用毒种和建立疫苗效力试验方法和评价疫苗有效性的方法和初步标准。方法 将SARS灭活疫苗进行系列稀释后免疫小鼠、原液疫苗免疫家兔，用异株病毒作为攻击毒以蚀斑减少法测定血清中和抗体，并与一组SARS病人恢复期血清的中和抗体水平进行比较。初步建立疫苗的效力试验方法和评价标准。结果 疫苗以不同稀释度免疫小鼠，能产生随不同稀释度疫苗相应梯度的中和抗体滴度。用原倍疫苗免疫的小鼠血清中和抗体可达495．2；原倍疫苗免疫家兔所产生的中和抗体GNT为55．0～79．9。无论是小鼠或家兔所产生的中和抗体对广东分离的病毒均较北京分离的病毒为高。南北不同区域的SARS病人恢复期血清中和抗体GMT为50．12～54．95，且发现北方人群样本的抗体高于南方人群样本。结论 用小鼠和家兔作疫苗的效力试验模型具有较好的敏感性和重复性，且产生的抗体水平较高：选用的攻击病毒对多批用不同毒株生产的疫苗免疫后的动物抗体具有较高的一致性，可用于评价疫苗的效力。     

反转录酶活性检测实时荧光定量PCR方法的建立

目的在传统产物增强性反转录酶（PERT）活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量PCR方法。方法以噬菌体MS2RNA为模板,设计、合成引物和探针,并分别以连续10倍倍比稀释的AMV反转录酶（1×10-1～1×10-9U/μl）标准品催化体外反转录反应合成相应cDNA。采用实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,并获得相应的PCR荧光值曲线,分析AMV反转录酶的相对活性。同时应用传统PERT方法对cDNA进行扩增,测定该方法的灵敏度。结果将AMV反转录酶标准品连续10倍倍比稀释后催化反转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的反转录产物cDNA,结果得到与理论值完全相符合的PCR标准荧光值曲线;定量分析结果显示,浓度为1×10-2～1×10-8U/μl的AMV反转录酶均可得到相应的荧光值。不同稀释度的AMV反转录酶,经传统PERT方法扩增后,结果显示浓度为1×10-3～1×10-7U/μl的AMV反转录酶均可见大小为112bp的阳性条带,检测灵敏度达到1×10-7U/μl。结论成功建立了基于实时荧光定量PCR技术的检测反转录酶活性的新方法,实验操作简单,具有高精确性和无污染性,为生物制品外来污染尤其是反转录病毒污染的检测提供了参考指标。     

中国黄热疫苗减毒株和世界卫生组织黄热疫苗标准株基因全序列分析

目的研究中国黄热疫苗生产用减毒株与世界卫生组织（WHO）黄热疫苗标准株的基因序列,了解其核苷酸序列变异程度,和与其相关的氨基酸是否发生突变。方法根据基因库（GenBank）中收录的黄热病毒（Yellow Fever Virus,YFV）17D序列设计引物,提取该两株YFV的核酸,逆转录后进行聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）扩增病毒各部分基因片段,PCR产物纯化后直接测序,5＇和3＇端TA克隆后进行测序,然后进行遗传进化分析。经核苷酸序列测定进行序列比对分析。结果经序列测定后,进行两株YFV的序列比对,并与GenBank中收录的其它相关YFV17D疫苗株和野毒株进行序列比对,发现中国黄热疫苗生产株与WHO黄热疫苗标准株间的核苷酸序列并未发生较大变异,核苷酸和氨基酸的同源性分别约为99%和99%。其重要病毒抗原E蛋白也未发生较大突变,但发现E区与毒力密切相关的173位氨基酸发生回复突变,进一步通过系统发生分析说明两者亲缘关系十分接近。结论传代过程中,中国黄热疫苗株和WHO黄热疫苗标准株在基因水平上除个别外未发生较大改变,其基因组具有一定的稳定性。     

非典型肺炎灭活疫苗免疫动物效果评价

目的应用空斑减少中和试验对非典型肺炎灭活疫苗动物免疫血清进行中和抗体测定,以评价其免疫效果。方法用Vero-E6细胞接种6孔塑料细胞培养板,加两层含琼脂糖培养基,以中性红为染色剂建立空斑试验,以能减少50%的空斑为标准测定抗SARS中和抗体。结果三批非典型肺炎灭活疫苗免疫小鼠和家兔均产生较高的中和抗体。结论非典型肺炎灭活疫苗对两种动物具有良好的免疫效果。     

Observation on the Efficiency of the Mongolian Gerbil Kidney Tissue Culture Inactivated Bivalent Vaccine for Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome

Hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) is a ro dent transmitted acute infectious disease characterized byvarious degrees of renal insufficiency and extensive hemor rhage in the body. It is caused by viruses belonging toHantavirus of the f…     

反转录酶活性检测实时荧光定量PCR方法的建立

目的 在传统产物增强性反转录酶(PERT)活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量PCR方法.方法 以噬菌体MS2 RNA为模板,设计、合成引物和探针,并分别以连续10倍倍比稀释的AMV反转录酶(1×10-1～1×10-9 U/μl)标准品催化体外反转录反应合成相应cDNA.采用实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,并获得相应的PCR荧光值曲线,分析AMV反转录酶的相对活性.同时应用传统PERT方法对cDNA进行扩增,测定该方法的灵敏度.结果 将AMV反转录酶标准品连续10倍倍比稀释后催化反转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的反转录产物cDNA,结果得到与理论值完全相符合的PCR标准荧光值曲线;定量分析结果显示,浓度为1×10-2～1×10-8U/μl的AMV反转录酶均可得到相应的荧光值.不同稀释度的AMV反转录酶,经传统PERT方法扩增后,结果显示浓度为1×10-3～1×10-7 U/μl的AMV反转录酶均可见大小为112 bp的阳性条带,检测灵敏度达到1×10-7U/μl.结论 成功建立了基于实时荧光定量PCR技术的检测反转录酶活性的新方法,实验操作简单,具有高精确性和无污染性,为生物制品外来污染尤其是反转录病毒污染的检测提供了参考指标.