探针ASPCR检测肺炎支原体 微量耐药突变A2063G方法的建立

[摘要]　目的　 建立能够特异性检测微量肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae, MP）A2063G耐药突变基因的特异性扩增等位基因的探针法实时定量PCR（probe-based allele-specific real-time PCR, 探针ASPCR）方法。方法?建立特异性检测A2063G耐药突变位点的探针ASPCR方法,并验证其灵敏度、特异度及准确度等性能。结果?特异性扩增2063G和非特异性扩增2063A/G的引物/探针组合分别扩增105拷贝野生基因型（2063A）模板的Ct值的差(△Ct)高达10.93,能够特异性检测A2063G突变。探针ASPCR方法检测2063G基因型占总MP的比例的准确度可低至1％;检测MP的灵敏度低至10拷贝,检测A2063G耐药突变比例的灵敏度低至0.01％。探针ASPCR方法与前期建立的染料ASPCR方法检测临床样本的MP感染结果一致,MP阳性检出率均为94.83%（55/58）,高于传统巣式PCR联合测序方法的检测结果（75.86%,44/58）;探针ASPCR和染料ASPCR 2种方法检测MP耐药率分别为63.64%（35/55）、70.91%（39/55）,高于传统巣式PCR联合测序方法检测结果59.09%（26/44）。结论?新建探针ASPCR方法是一种具有高特异度、准确度和灵敏度的快速检测MP微量A2063G耐药突变的方法;与染料ASPCR方法相比,探针ASPCR方法检测耐药MP的灵敏度略低,但其临床样本检测复查率也低于染料ASPCR方法,且其结果判读简单,更适合在临床中应用推广,能够为临床制定MP及耐药MP感染的治疗方案提供理论依据。     

蛭丹化瘀口服液体外抑制病原微生物的实验研究

目的　探讨活血化瘀方药蛭丹化瘀口服液 (简称CBMV)对常见致病微生物的抑制作用。方法　对呼吸道合胞病毒 (RSV)、肺炎支原体 (MP)以及常见致病细菌 :肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌等进行了体外抑毒抑菌实验。结果　蛭丹化瘀口服液 (CBMV)完全抑制RSV发生细胞病变的药物浓度为 2 .75mg/ml;对MP的最小抑菌浓度为 5 .5mg/ml;对肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌的最小抑菌浓度均为 1 1 0mg/ml,对金黄葡萄球菌及绿脓杆菌分别为 2 2 0mg/ml及 <5 .5mg/ml,但对大肠杆菌无效。结论　上述结果表明 ,活血化瘀方药CBMV不仅通过改善微循环、防治弥漫性血管内凝血、清除氧自由基等多种作用 ,促进了小儿肺炎的康复 ,而且通过一定程度的抗微生物作用 ,使活血化瘀疗法的扶正祛邪的作用更加完善。     

肺炎支原体肺炎患儿口咽部常见细菌及临床意义北大核心CSCD

目的:了解肺炎支原体肺炎(MPP)患儿口咽部常见细菌及临床意义。方法:回顾性分析。选取中国医科大学附属盛京医院小儿呼吸内科2016年12月至2017年6月住院治疗的134例MPP患儿为研究对象,选取同期同医院42例健康儿童为健康对照组。采用荧光定量聚合酶链反应Taqman探针法检测入组儿童口咽部常见细菌[肺炎链球菌(SP)、卡他莫拉杆菌(CTA)、流感嗜血杆菌(HI)]。首先比较MPP患儿及健康儿童口咽部细菌检出情况,再将134例MPP患儿根据年龄(<1岁、1~<3岁、3~<6岁及6~14岁)、有无细菌检出[肺炎支原体(MP)、MP+细菌]及检出菌种不同(MP+SP、MP+CTA及MP+HI)进行分组比较。采用秩和检验及 χ^(2)检验对相关临床资料进行分析。 结果:134例MPP患儿检出细菌79例(58.96%),42例健康儿童检出细菌17例(40.48%),差异有统计学意义( χ^(2)=4.404, P<0.05)。与MP组相比,MP+细菌组外周血中白细胞(WBC)水平[8.5(6.7,12.0)×10^(9)/L比7.8(5.8,9.3)×10^(9)/L, Z=-2.232]、C反应蛋白(CRP)水平[19.2(7.2,35.0) mg/L比8.4(3.4,24.6) mg/L, Z=-2.810]、乳酸脱氢酶(LDH)水平[286(244,365) U/L比250(210,302) U/L, Z=-2.474]及大叶性肺炎比例[40.51%(32/79例)比18.18%(10/55例), χ^(2)=7.510]、胸腔积液比例[13.92%(11/79例)比3.64%(2/55例), χ^(2)=3.917]、难治性肺炎支原体肺炎(RMPP)比例[34.18%(27/79例)比18.18%(10/55例), χ^(2)=4.151]均较高;总热程[10(7,12) d比8(6,10) d, Z=-2.706]及抗生素使用时间[16(13,19) d比12(9,16) d, Z=-3.747]均较长,差异均有统计学意义(均 P<0.05)。MP+SP组外周血中WBC高于MP+HI组[12.20(7.80,17.30)×10^(9)/L比6.75(5.37,9.44)×10^(9)/L],差异有统计学意义( Z=11.574, P<0.05);MP+SP组[56.67%(17/30例)]大叶性肺炎发生率高于MP+CTA组[0(0/3例)]和MP+HI组[18.75%(3/16例)],差异有统计学意义( χ^(2)=9.770, P<0.05)。 结论:MPP患儿口咽部更易发生细菌定植或感染,当WBC、CRP及LDH均明显升高,影像表现为大片实变影或有胸腔积液时,提示可能混合细菌感染,热程更长,难治性MPP比例增高,且常见的混合细菌为SP。     

肺炎支原体肺炎患儿支气管肺泡灌洗液中肺炎支原体耐药基因和13种病原检测结果分析北大核心CSCD

目的:了解肺炎支原体肺炎(MPP)患儿支气管肺泡灌洗液(BALF)中肺炎支原体(MP)耐药基因和13种呼吸道病原的分布情况。方法:回顾性选择2018年1月至2019年1月北京大学第三医院和北京大学第一医院100例MPP患儿的BALF标本,采用荧光定量PCR法检测MP核酸及其耐药基因,采用多重PCR核酸检测技术测定甲型流感病毒、甲型流感病毒H_(1)N_(1)、甲型流感病毒H_(3)N_(2)、乙型流感病毒、人副流感病毒、腺病毒、人博卡病毒、人鼻病毒、肺炎衣原体、人偏肺病毒、MP、人冠状病毒和呼吸道合胞病毒核酸,采用 χ^(2)检验进行分析。 结果:100例BALF标本,荧光定量PCR法检测MP及耐药基因,83例(83.00%)MP阳性,其中78例(93.98%)耐药,均为23S rRNA结构域V区A2063G的点突变。多重PCR法检测13种呼吸道病原,89例(89.00%)阳性。79例(79.00%)检测到MP,其中74例(74.00%)仅检出MP,5例(5.00%)同时检出MP合并其他病原。10例(10.00%)检测出其他病原。0~4岁组病毒检出率高于>4~6岁组( P=0.042)和>6岁组( P=0.002),差异均有统计学意义。 结论:MPP患儿的BALF标本绝大部分可检测到MP,耐药现象严重,以A2063G的点突变为主。少数BALF标本中可检测到其他呼吸道病原和2种或3种病原。     

肺炎支原体感染认识新进展

肺炎支原体在各个年龄段都是明确的呼吸道致病菌,它通过极样黏附细胞器吸附在宿主细胞表面,产生过氧化物离子和可能的外毒素,甚至可能直接入侵宿主细胞导致潜伏感染。诱发的免疫反应性损伤也是肺炎支原体引起临床症状的主要因素之一。肺炎支原体诊断最好结合PCR和血清学检测,而且鼻咽和口咽标本同时取材进行PCR检测,不同病程2次血清学检测能获得最可靠的诊断依据,培养方法对于肺外支原体感染和体外药物敏感试验十分重要。     

肺炎支原体基因分型的研究进展

肺炎支原体(MP)是儿童院内和社区呼吸道感染最常见的病原体之一.目前国内外报道公认,根据MP菌株P1基因序列变化,应用P1基因的PCR产物限制性内切酶片段长度多态性分析、DNA指纹图谱分析等分子生物学技术可将MP分为Ⅰ型和Ⅱ型,同一型中又可分为不同亚型.对MP型别的了解有助于深入了解MP的生物学特性,对其致病机制和流行病学研究也有一定帮助.该文从MP基因分型的依据、各种应用于分型的分子生物学方法以及国内外分型结果作一综述.     

肺炎支原体对大环内酯类抗生素的耐药分子机制

目的了解肺炎支原体(MP)对大环内酯类抗生素的耐药分子机制。方法对370例咽拭子标本进行MP分离培养,应用巢式PCR扩增MP种特异16S rRNA基因对临床分离株进行分子鉴定;通过体外药物敏感试验测定MP临床分离株对红霉素的最小抑菌质量浓度(MIC),并筛选出耐药株;除23S rRNA结构域Ⅴ区外,通过PCR扩增与大环内酯类抗生素耐药性有关的23S rRNA结构域Ⅱ区及核糖体蛋白L4、L22的基因,扩增产物进行全自动DNA测序,测得序列与美国国立生物信息中心已登录的MP标准株M129的相应基因序列作比对。结果370例咽拭子标本中分离MP50株。其中敏感株4株,耐药株46株。耐药株的红霉素MIC显著升高。50株临床分离株和标准株FH均未出现23S rRNA结构域Ⅱ区的基因突变。在核糖体蛋白L4中,其中6株临床分离株和标准株FH分别出现了58位C→A、66位T→G、81位G→T、162位C→A和(或)430位A→G点突变。在核糖体蛋白L22中,50株临床分离株和标准株FH均出现了508位T→C点突变,且其中11株和标准株FH还分别出现了62位C→A、65位T→A和(或)279位T→C点突变。结论MP对大环内酯类抗生素耐药现象严重,23S rRNA结构域Ⅴ区中心环的药物作用靶位基因突变是耐药性产生的主要机制。在使用大环内酯类药物治疗的过程中,有体内诱导出耐药株的可能性。     

难治性肺炎支原体肺炎5例

目的 探讨难治性肺炎支原体肺炎的临床特点.方法 2003年12月-2006年1月首都医科大学附属北京友谊医院儿科住院的难治性肺炎支原体肺炎患儿5例.男4例,女1例;年龄6～13岁.对5例患儿的临床表现、实验室检查、胸片检查及治疗进行回顾性分析.结果 肺炎支原体肺炎5例患儿均以发热、咳嗽起病,呈稽留高热,体温40.0～40.7℃,咳嗽剧烈,患侧肺部叩诊浊音,呼吸音减低.5例ESR增快(53～107mm/1h),CRP升高(270～1600mg/L);2例行细胞免疫功能检查CD4 /CD8 降低;胸片示左中下肺野大片状阴影3例,右中下肺野大片状阴影2例,均并胸腔积液.5例均并心电图异常改变,3例表现为T波低平,2例表现为左前分支传导阻滞,心肌酶CK-MB、肌钙蛋白T均正常.5例咽拭子肺炎支原体培养阳性,体外药物敏感性试验证实为耐药菌感染.5例均予大环内酯类药物治疗.其中1例加用甲泼尼龙治疗,热程缩短.随访2～3个月,全部病例肺部炎性反应吸收,1例并胸膜肥厚.结论 耐药肺炎支原体感染诊治困难,对大环内酯类抗生素治疗不敏感不能排除肺炎支原体肺炎,应行病原学检查及耐药基因检测,同时需寻找有效的药物控制耐药菌感染.     

婴幼儿血清25-羟维生素D水平与佝偻病的关系

目的通过对婴幼儿进行佝偻病指标调查、检测与分析,了解北京地区婴幼儿血清维生素D水平,探讨维生素D缺乏性佝偻病诊断中需注意问题。方法对北京地区2004年2月-2005年8月收治72例年龄为2~24个月的体检和就诊婴幼儿,进行临床症状询问,进行体格检查,根据临床表现初步作出有无佝偻病诊断。取血查其血清25羟-维生素D[25-(OH)D]及血清钙、磷、碱性磷酸酶(ALP)和小儿骨源性碱性磷酸酶(NBAP)水平。部分小儿行左腕X线片检查。结果单纯根据临床症状、体征诊断为无佝偻病正常组婴幼儿30例,年龄(10.75±6.27)个月;判断为佝偻病者42例,年龄(9.05±5.55)个月。二组血清25-(OH)D、ALP及NBAP均无统计学差异。血清25-(OH)D水平降低者二组各有1例;较正常值增高者21例。佝偻病组无1例血清钙、磷水平降低,其平均值反而较正常组为高。二组分别有23例及31例行左腕X线摄片检查,无1例异常发现。结论北京地区大多数婴幼儿血清25-(OH)D及钙、磷水平正常。单纯以临床表现判断有无佝偻病时,既存在过度诊断问题,也有漏诊可能;应尽可能对疑诊患儿进行血清25-(OH)D水平检测,避免维生素D应用不足或过量。     

肺炎支原体感染的治疗

肺炎支原体（MP）是引起人类疾病的一种常见病原体,引起的肺炎和肺外并发症对儿童健康危害严重。MP感染的治疗一直是临床医师关注的热点。本文从抗生素的应用、中药治疗及免疫制剂三个方面对MP感染的治疗进行介绍。重点论述抗生素的应用目的,应用何种抗生素,大环内酯类抗生素的作用机制和耐药机制,大环内酯类抗生素的种类及应用方法。对常用的几种中药方剂和免疫治疗作以介绍。MP感染的各种治疗方法的有机结合对MP感染的控制非常必要。