探针ASPCR检测肺炎支原体 微量耐药突变A2063G方法的建立

摘要]　目的　 建立能够特异性检测微量肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae, MP）A2063G耐药突变基因的特异性扩增等位基因的探针法实时定量PCR（probe-based allele-specific real-time PCR, 探针ASPCR）方法。方法?建立特异性检测A2063G耐药突变位点的探针ASPCR方法，并验证其灵敏度、特异度及准确度等性能。结果?特异性扩增2063G和非特异性扩增2063A/G的引物/探针组合分别扩增105拷贝野生基因型（2063A）模板的Ct值的差(△Ct)高达10.93，能够特异性检测A2063G突变。探针ASPCR方法检测2063G基因型占总MP的比例的准确度可低至1％；检测MP的灵敏度低至10拷贝，检测A2063G耐药突变比例的灵敏度低至0.01％。探针ASPCR方法与前期建立的染料ASPCR方法检测临床样本的MP感染结果一致，MP阳性检出率均为94.83%（55/58），高于传统巣式PCR联合测序方法的检测结果（75.86%，44/58）；探针ASPCR和染料ASPCR 2种方法检测MP耐药率分别为63.64%（35/55）、70.91%（39/55），高于传统巣式PCR联合测序方法检测结果59.09%（26/44）。结论?新建探针ASPCR方法是一种具有高特异度、准确度和灵敏度的快速检测MP微量A2063G耐药突变的方法；与染料ASPCR方法相比，探针ASPCR方法检测耐药MP的灵敏度略低，但其临床样本检测复查率也低于染料ASPCR方法，且其结果判读简单，更适合在临床中应用推广，能够为临床制定MP及耐药MP感染的治疗方案提供理论依据。

Development of probe-based Allele-specific real-time PCR testingfor detection of minor A2063G resistance mutation in Mycoplasma Pneumoniae