重组Calpain蛋白的免疫原性及其诊断上的应用研究

目的研究在大肠杆菌中表达的日本血吸虫Calpain蛋白的免疫原性及其在日本血吸虫诊断上的应用. 方法用重组Calpain蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA法测定特异性IgG抗体的动态变化及其IgG亚型(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3)产生特征;同时用重组Calpain蛋白作为诊断抗原,粪检血吸虫病阳性患者血清作为一抗,肝吸虫阳性患者血清作为考核交叉反应血清. 结果重组Calpain抗原免疫小鼠后,产生了一个极高的抗Calpain特异性抗体,免疫4周后IgG类抗体达到高峰,与对照组鼠相比较,免疫鼠血清中IgG1, IgG2a, IgG2b特异性抗体也有显著性的上升; Calpain重组抗原血清诊断日本血吸虫和粪检的符合率为100%, 粪检阳性EPG低的个体抗Calpain抗体滴度高, EPG高的患者抗Calpain抗体滴度反而低, 与肝吸虫的交叉反应率为37%. 结论日本血吸虫Calpain是一个具有免疫原性的蛋白,能够激发宿主产生高水平的免疫球蛋白,能够敏感地测定日本血吸虫的感染, 说明Calpain可以发展成为日本血吸虫病的诊断抗原和日本血吸虫疫苗候选分子.     

日本血吸虫Calpain疫苗候选分子抗感染的免疫机制

目的探讨日本血吸虫疫苗候选分子—钙离子激活的中性蛋白激酶(Calpain)的保护性免疫力和免疫保护性机制。方法用重组纯化的Calpain抗原免疫BALB/c小鼠,制备抗Calpain血清,抗Calpain血清与机械转化的日本血吸虫童虫和来自于同种鼠激活的嗜酸性粒细胞共同培养,观察细胞对血吸虫童虫的粘附及对童虫的杀伤效果;RT-PCR分析Calpain抗原免疫BALB/c小鼠一氧化氮激酶(iNos.eNos.nNos)mRNA的表达;ELISA分析免疫小鼠体外培养脾细胞产生的细胞因子IFN-γ和IL-4。结果重组Calpain抗原免疫小鼠后,产生了一个极高的抗Calpain特异性抗体,此抗体介导了同种鼠的嗜酸性粒细胞对日本血吸虫童虫的粘附,37℃、5%CO2培养48h后,33.8%的日本血吸虫童虫被杀死,与控制组14.5%的自然死亡率相比有一个显著性的增高(P<0.01);RT-PCR测定重组Calpain抗原免疫1周小鼠iNosmRNA的表达显著性的增强,培养24h脾细胞上清中IFN-γ浓度高于对照组。结论Calpain特异性抗体介导了对日本血吸虫童虫的细胞毒作用,Calpain抗原能够诱导IFN-γ的产生,提示Calpain诱导Th1的免疫应答反应来抗日本血吸虫的感染。     

MCF-7耐米托蒽醌细胞株甲基化结合蛋白表达

目的 研究乳腺癌细胞(MCF-7)经米托蒽醌诱导耐药后其甲基化结合蛋白(Methyl-DNA-binding protein,MBD)的表达变化,并分析在MCF-7细胞经诱导产生多药耐药性中与甲基化结合蛋白的关系.方法 利用耐米托蒽醌的MCF-7耐药株,并用未染毒的野生型MCF-7为对照,通过蛋白印迹法检测不同浓度米托蒽醌处理的细胞组乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)和甲基化结合蛋白MBD1、MBD2及MBD4的蛋白表达水平.结果 跟野生型MCF-7比较,随着染毒浓度的增大,乳腺癌耐药蛋白BCRP的表达逐渐增加,而MBD1、MBD2、MBD4的表达均呈降低趋势,且MBD4的降低尤为明显,与对照组比较,其MBD4蛋白表达水平分别为(0.910±0.049)、(0.835±0.065)、(0.708±0.082)、(0.660±0.145)(P＜0.05).结论 在米托蒽醌诱导产生耐药的MCF-7细胞株中,MBDs的表达,尤其是MBD4,有可能参与了肿瘤耐药的形成.     

德国小蠊细胞色素P450 CYP4G19基因的原核表达及多克隆抗体制备

目的 构建细胞色素P450 CYP4G19基因部分片段的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备CYP4G19多克隆抗体.方法 应用RT-PCR扩增CYP4G19基因部分片段,产物经T-A克隆、测序鉴定,亚克隆入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,镍离子亲和层析法纯化重组蛋白后,免疫小鼠,获得多克隆抗体,ELISA及Western.blot检测多抗的效价及特异性.结果 从德国小蠊cDNA中克隆出一段771bp的亲水性基因片段,在大肠杆菌中诱导表达出约32000 Mr、以包涵体形式存在的P450重组蛋白.将纯化、复性的重组蛋白免疫 9,得到了滴度高于1:10<'6>的高效价多克隆抗体.Western-blot显示此多抗能与32000 Mr的重组蛋白特异结合.并能识别天然的德国小蠊微粒体P450蛋白.结论 利用原核表达的CYP4G19融合蛋白具有良好的免疫原性.制备出效价高、特异性强的抗德国小蠊CYP4G19多克隆抗体,为下一步关于德国小蠊CYP4G19蛋白表达特性及其抗药性功能的深入研究提供了重要的实验工具.     

雌激素受体α介导氧化磷酸化通路在肺癌发生中的作用

目的：通过生物信息学方法探讨雌激素受体α（ESRRA）在肺癌发生发展中的作用。方法：利用UALCAN在线平台对人肺癌组织（包括肺腺癌与肺鳞癌）和癌旁正常肺组织中ESRRA基因的表达变化进行分析,并利用Kaplan-Meier Plotter数据库对肺癌中ESRRA及其相关基因的表达进行生存分析。利用GEPIA2在线平台获得与ESRRA表达模式相似的前50个基因,在GeneMANIA在线平台上构建这50个基因编码的蛋白质-蛋白质的相互作用网络,并通过DAVID数据库对该50个基因群进行GO分析和KEGG通路富集。通过TIMER 2.0在线平台分析肺癌组织中ESRRA与富集在氧化磷酸化通路中核心基因表达水平的相关性。利用Western blot法验证ESRRA蛋白在肺癌细胞系中的表达水平。结果：与癌旁正常肺组织相比,ESRRA在肺癌组织中高表达（P<0.01）,ESRRA表达水平高的肺癌患者显示出较差的预后（P<0.01）。与ESRRA表达模式相似的前50个基因主要富集在氧化磷酸化通路,包括ATP5B、ATP5G3、COX5A、COX8A、SDHD、UQCRC1和UQCRC2。其中ATP5B、COX8A和UQCRC1在肺癌组织中的表达水平与ESRRA的表达呈正相关（P<0.05）。ATP5B、ATP5G3、COX5A、COX8A、SDHD、UQCRC1和UQCRC2在肺癌组织中均高表达,ATP5B、ATP5G3、COX5A、COX8A表达水平高和SDHD表达水平低的肺癌患者均显示出较差的预后（P<0.01）。Western blot验证结果显示,与正常人支气管上皮16HBE细胞相比,ESRRA蛋白的相对表达水平在肺腺癌NCI-H1975细胞和肺鳞癌SW900细胞中均高表达（P<0.01）。结论：ESRRA介导氧化磷酸化通路中ATP5B和COX8A的表达改变引起能量代谢紊乱可能是其促进肺癌发生和导致肺癌不良预后的原因之一。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因克隆、表达及其抗血清在食物中毒快速检测上的应用

目的克隆和表达金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）基因，制备金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）的多克隆抗体，应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的诊断。方法用核酸扩增技术从金黄色葡萄球菌菌株中分离产生肠毒素B的标准菌株，采用高保真PCR技术从金黄色葡萄球菌野生株中扩增全长SEB，目的片段经TA克隆后DNA序列测定，重组质粒pGEM—SEB经酶切获得的SEB基因片段与真核表达载体pGEX-4T-3连接，将重组真核载体pGEX-4T-3-SEB转化人E．coli BL21（DE3）株，在0．1mmol／LIPTG诱导下，诱导SEB基因在E-coli BL21（DE3）株中表达，用谷光苷肽Sepharose4B柱分离纯化GST融合蛋白，用SDS—PAGE检测重组SEB（rSEB）的表达，重组蛋白免疫BALB／c小鼠获得抗血清，并用抗血清与天然的SEB和rSEB进行Westembolt分析。结果成功克隆了822bpSEB基因，编码272个氨基酸，在E．coli BL21（DE3）株中表达了rSEB，分离纯化的rSEB能够诱导小鼠产生IgG抗体，此抗体不仅能够与rSEB反应，而且能够与天然的SEB特异性的反应。结论重组SEB具有抗原特性，制备的特异性抗体可应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的快速诊断，将能够建立特异性强、敏感性高的金黄色葡萄球菌的诊断体系，同时也有助于对SEB在抗肿瘤机制、炎症过程中的作用等方面研究。     

毛细管电泳法检测耐米托蒽醌乳腺癌细胞系全基因组甲基化水平

目的： 建立对米托蒽醌(Mit)耐药的乳腺癌MCF-7细胞系,并探讨乳腺癌细胞产生耐药与其基因组甲基化水平之间的关系。方法：用0.005、0.010和0.020 μmol/L浓度的米托蒽醌染毒乳腺癌MCF-7细胞,建立对米托蒽醌不同耐药程度的MCF-7耐药细胞系,采用流式细胞术检测各染毒组MCF-7细胞内药物荧光强度D(755)值,确定Mit耐药细胞系的建立;提取各组细胞的DNA, 利用毛细管电泳法检测野生型对照组及各染毒组细胞全基因组DNA甲基化水平。结果：野生型对照组、0.005、0.010和0.020 μmol/L米托蒽醌染毒组的D(755)值依次为16.1±0.04、14.3±0.12、13.3±0.07和9.7±0.08,与野生型对照组相比,随着药物染毒浓度的增加,MCF-7细胞内药物的D(755)值逐渐减少,其中0.020 μmol/L染毒组较对照组显著减少,差异有统计学意义 (P<0.05),表明细胞耐药性增强;而上述各组DNA甲基化水平依次为42.25%±0.64%、37.97%±1.18%、34.27%±0.14%、31.16%±0.80%,与野生型对照组相比,各染毒组细胞基因组DNA甲基化水平逐渐降低 (P<0.05),且各染毒组间两两比较差异均具有统计学意义 (P均<0.05)。结论：成功建立了对Mit耐药的MCF-7细胞系;确定了毛细管电泳法检测基因组DNA甲基化水平的电泳分离条件。     

产肠毒素D金黄色葡萄球菌的筛选及其基因克隆和蛋白表达

目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素D基因（entD），表达和纯化其重组蛋白（rSED），以进一步制备抗rSED抗体，研制SED金标免疫快速检测试纸条。方法利用PCR技术．从野生型金黄色葡萄球菌中筛选产肠毒素D金黄色葡萄球菌标准株，扩增entD基因，克隆至pGEM—T Easy载体．亚克隆至原核表达载体pET28a，重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达蛋白，Ni-NTA亲和层析纯化蛋白，免疫印迹检测抗原活性。结果分离获得1株产肠毒素D金黄色葡葡球菌标准株．成功克隆entD序列．测序表明该基因共684bp，与其他entD序列（GenBank登陆号：M28521）具有99％的同源性。rSED蛋白在大肠杆菌中得到高效的可溶性表达。免疫印迹结果表明．rSED蛋白能被抗天然SED抗体识别。结论通过基因重组技术制备的重组SED蛋白具有良好的免疫反应性。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因克隆、表达及其抗血清在食物中毒快速检测上的应用

目的克隆和表达金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）基因，制备金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）的多克隆抗体，应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的诊断。方法用核酸扩增技术从金黄色葡萄球菌菌株中分离产生肠毒素B的标准菌株，采用高保真PCR技术从金黄色葡萄球菌野生株中扩增全长SEB，目的片段经TA克隆后DNA序列测定，重组质粒pGEM—SEB经酶切获得的SEB基因片段与真核表达载体pGEX-4T-3连接，将重组真核载体pGEX-4T-3-SEB转化人E．coli BL21（DE3）株，在0．1mmol／LIPTG诱导下，诱导SEB基因在E-coli BL21（DE3）株中表达，用谷光苷肽Sepharose4B柱分离纯化GST融合蛋白，用SDS—PAGE检测重组SEB（rSEB）的表达，重组蛋白免疫BALB／c小鼠获得抗血清，并用抗血清与天然的SEB和rSEB进行Westembolt分析。结果成功克隆了822bpSEB基因，编码272个氨基酸，在E．coli BL21（DE3）株中表达了rSEB，分离纯化的rSEB能够诱导小鼠产生IgG抗体，此抗体不仅能够与rSEB反应，而且能够与天然的SEB特异性的反应。结论重组SEB具有抗原特性，制备的特异性抗体可应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的快速诊断，将能够建立特异性强、敏感性高的金黄色葡萄球菌的诊断体系，同时也有助于对SEB在抗肿瘤机制、炎症过程中的作用等方面研究。     

空间飞行对稻田鱼腥藻遗传特性的影响

通过对具有高固氮酶活性的稻田鱼腥藻近地克隆株（ＡｏＳＲ１６）的回复再搭载及其返地样品的单克隆实验，发现空间飞行环境能导致该藻株再次出现性状分离现象，即部分单克隆朱仍保持高固氮酶活性（如ＡｏＳＲ１６－１７），而另一部分单克隆株则回复到原始出发株（ＡｎａｂａｅｎａｏｒｙｚａＨＢ２３）的固氮酶活性水平，对ＡｏＳＲ１６－１７进行近两年的地面保持培养发现，这种高固氮酶活性的性状是可以遗传的，进一步通过ＲＡＰ