广东部分地区健康人群GSTP1基因多态性研究

目的 了解谷胱甘肽-S-转移酶P1(GSTP1)基因多态性在广东省部分地区健康人群中的分布规律。方法 应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法检测广东省粤语言地区224名健康人GSTP1基因型。应用SPSS软件进行统计分析。结果 在所调查人群中野生纯合子GSTP1 ^*A^*/A基因型的频率为66．5％(149／224)；杂合子GSTP1 ^*A/^*G在人群占26．8％，突变纯合子GSTP1 ^*G/^*G占6．7％。经检验这种分布在不同性别、职业、地区以及生活方式人群中的分布均衡。结论 二分类Logistic回归分析结果显示，高血压、冠心病、脑卒中、肺癌及鼻咽癌等家族史在人群中的发生与人群GSTP1不同基因型的分布无显著相关关系。     

细胞衰老过程中P16表观遗传学修饰研究

目的 检测体外培养的人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程及细胞早衰阶段中P16的表观遗传学调控作用.方法 在细胞复制性衰老过程(同步培养的22 PDL正常人胚肺成纤维细胞于约50%融合度时进行400μmol/L H2O2处理,每天用H2O2染毒工作液染毒1次,每次2 h,持续4 d)中,将正常人胚肺成纤维细胞分为年轻细胞组(22 PDL)、中年细胞组(35 PDL)、复制性衰老细胞组(49 PDL);将经400μmol,L H2O2染毒4 d的22 PDL人胚肺成纤维细胞继续培养7 d,设为早衰细胞组.荧光定量PCR检测P16的mRNA表达水平,甲基化特异PCR检测其肩动子区-846～-639 bp的甲基化水平,染色质免疫沉淀结合定量PCR检测其相应启动子区组蛋白修饰情况,包括组蛋白H3、H4乙酰化和H3(Lvs4)及H4(Lvs20)甲基化修饰.结果 与年轻细胞组相比,中年细胞组P16的mRNA表达降低,复制性衰老细胞组和早衰细胞组P16的mRNA表达升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).在P16启动子区,第一外显子上游-1 000 bp内,其CpG岛片段长度为995 bp,甲基化特异性PCR(MSP)扩增片段位于CpG岛内-84～-639 bp之间,长度为208 bp.中年细胞组、复制性衰老细胞组、早衰细胞组甲基化引物扩增产物的相对含量分别为0.42、0.34、0.47,未甲基化引物扩增产物的相对含量分别为0.61、0.96、0.79.在P16 IP1启动子区(-685～-489 bp),复制性衰老细胞组及早衰细胞组以组蛋白H4(Lys20)甲基化修饰为主;在P16 IP2启动子区(-229～-60bp),复制性衰老细胞组受组蛋白H3、H4乙酰化和H4(Lys20)甲基化联合修饰,早衰细胞组以H3、H4乙酰化修饰为主.结论 细胞衰老过程中,P16启动子区的组蛋白修饰联合调控其mRNA表达,复制性衰老与早衰的调控机制存在差异.     

1,2-二氯乙烷对大鼠肝细胞内游离钙离子浓度的影响

目的了解1，2-二氯乙烷染毒24h对大鼠肝细胞的损伤及其机理。方法运用显微荧光术测定了大鼠肝细胞内游离钙离子浓度，同时，测定了大鼠肝细胞培养上清液乳酸脱氢酶（LDH）活力作为大鼠肝细胞受损的指标。结果所有剂量组的1，2-二氯乙烷的大鼠肝细胞内游离钙离子浓度与对照组比较差异均无显著性（P〉0．05）；LDH活力仅在浓度为5mmol／L的1，2-二氯乙烷染毒组与对照组比较差异也无显著性（P〉0．05）；而1，2-二氯乙烷其他染毒组（即浓度为10mmol／L和20mmol／L）与对照组比较差异均有显著性（P〈0．01）。结论较高浓度（10mmol／L和20mmol／L）的1，2-二氯乙烷能损伤大鼠肝细胞，损伤的途径不是通过破坏肝细胞内钙稳态机制。     

反式二羟环氧苯并(a)芘所致人支气管上皮细胞POLK基因高表达

目的观察不同剂量反式二羟环氧苯并(a)芘(anti-BPDE)处理对人支气管上皮细胞(16HBE)POLK基因表达的影响。方法分别以0.25、0.50、1.00、2.00μmol/L的反式-BPDE1次或3次处理16HBE细胞,采用TaqmanMGB探针实时定量聚合酶链反应方法相对定量POLK和POLZ基因表达,同时对反式-BPDE转化的16HBE及肺癌H1299细胞POLK基因表达进行了分析。结果反式-BPDE1次处理及3次处理可诱导正常16HBEPOLK基因高表达。反式-BPDE转化16HBE和肺癌H1299细胞POLK基因表达明显增高,分别是正常16HBE的2.25和5.49倍。结论反式-BPDE处理可致16HBEPOLK基因高表达。     

氢醌对人L-02肝细胞泛素连接酶Rad18表达的影响

目的 研究氧醌(hydroquinone,HQ)对人L-02肝细胞中泛素连接酶Pad18表达的影响,探讨Rad18在HQ所致肝细胞毒性中的作用及其可能机制.方法 将L-02肝细胞用不同浓度(0、5、10、20、40、80和160 μmol/L)的HQ作用24 h,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞存活率;用单细胞凝胶电泳检测DNA损伤情况;实时荧光定量PCR技术检测Rad18在mRNA水平上的表达;Western blot方法检测Pad18在蛋白质水平上的表达.结果 在0-80 μmoFL的范嗣内,HQ对L-02肝细胞的存活率没有明显的影响,当染毒剂量超过160 μmol/L时,细胞存活率(79.20%)明显下降,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01).随着 HQ作用浓度的升高,L-02肝细胞的Olive尾矩也逐渐增加,呈线性正相关关系(r=920,P<0.01).在HQ染毒剂量低于40μmol/L的范围内,Rad18在mRNA和蛋白质水平上的表达均有随着剂量的增加而增加的趋势;当HQ的剂量超过40 μmol/L时,Pad18在mRNA水平上的表达继续增加,而其在蛋白质水平上的表达则无明显变化.结论 HQ可使L-02肝细胞的Rad18表达增加.     

人胚肺成纤维细胞衰老过程中Foxa2启动子区CpG岛的甲基化状态

目的探讨人胚肺成纤维细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的早衰过程中Foxa2的表达改变及其启动子区CpG岛的甲基化水平变化。方法按传代情况将人胚肺成纤维细胞分为年轻细胞[第22代细胞,即22 PDL(populationdoubling levels,群体倍增水平)]组、中年细胞(35PDL)组、复制性衰老细胞(49PDL)组和氧化应激诱导的早衰细胞(premature senescence,PS)组。用荧光定量PCR方法检测人胚肺成纤维细胞衰老过程中Foxa2的mRNA表达改变,应用甲基化特异性PCR(MSP)检测启动子区-777～-478 bp甲基化的变化情况,并用亚硫酸氢盐修饰基因组结合克隆测序检测启动子区域CpG岛的甲基化水平。结果与年轻细胞组比较,中年细胞组人胚肺成纤维细胞Foxa2 mRNA的表达水平无明显变化;而复制性衰老细胞组和早衰细胞组人胚肺成纤维细胞Foxa2的mRNA表达水平均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。早衰细胞组的启动子区具有一定的甲基化水平;年轻细胞组、复制性衰老细胞组及早衰细胞组Foxa2启动子区CpG岛的甲基化水平分别为5.7%,17.1%和43.6%。结论人胚肺成纤维细胞衰老过程中Foxa2的mRNA表达水平逐渐降低,其启动子区CpG岛甲基化水平逐渐升高,参与其表达调控。     

双酚A与苯并[α]芘联合作用对三种乳腺上皮细胞的DNA损伤效应

[目的]观察双酚A(BPA)与苯并[α]芘(BaP)联合作用对三种乳腺上皮细胞DNA损伤的影响. [方法]采用对DNA双链断裂标志pH2AX免疫荧光检测的方法,观察环境相关剂量水平(10-9,10-7 mol/L)BPA、10-9 mol/L17-β-雌二醇(雌激素对照)及其与10-6 mol/L BaP联合作用对人乳腺上皮细胞(HMEC)、人永生化乳腺上皮细胞MCF-10A(CRL-10317)和人乳腺上皮肿瘤细胞MCF-7三种乳腺上皮细胞的DNA损伤效应(以二甲基亚砜作为溶剂对照),并应用实时荧光定量聚合酶链反应法检测三种细胞雌激素受体α和雌激素受体β的基因ESR1、ESR2mRNA水平的相对表达量.[结果] BPA对三种类型乳腺上皮细胞pH2AX阳性率均无明显影响.BaP可明显增加HMEC和MCF-7两种乳腺上皮细胞pH2AX阳性率:单独染毒时两种细胞pH2AX阳性率分别由(34.7±2.2)％和(3.1±0.3)％增至(63.6±1.2)％和(13.3±0.4)％;与10-7 mol/LBPA、10-9 mol/L 17-β-雌二醇分别联合作用可使MCF-7的pH2AX阳性率增至(15.1±0.2)％、(17.5±1.0)％,与单独染毒组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).三种细胞内ESR1、ESR2基因表达有差异,其中ESRI基因表达差异明显,在MCF-7中的表达水平最高,为HMEC的1 080倍、MCF-10A的5222倍. [结论]BPA与BaP联合作用与BaP单独作用相比,可引起MCF-7的DNA双链断裂损伤加剧,该作用可能与雌激素受体表达水平相关.     

hPARP-1高表达HaCaT细胞株的建立

目的建立hPARP-1过表达的HaCaT细胞株,观察过表达该基因后所引起的生物学效应。方法常规提取人皮肤角质细胞HaCaT的总RNA,RT-PCR扩增PARP-1全长cDNA基因片段,构建含PARP-1全长cDNA基因片段的真核表达载体pEGFP-PARP-1,通过BglⅡ、xhoⅠ双酶切及测序鉴定其正确性。利用脂质体将pEGFP-N2和pEGFP-PARP-1分别转染人皮肤角质细胞HaCaT,通过G418加压筛选,建立稳定高表达hPARP-1的HaCaT-PARP-1细胞株,并采用Realtime Q-PCR和Western blotting检测其mRNA和蛋白的表达水平。结果 RT-PCR扩增产物经BglⅡ、xhoⅠ双酶切后,与pEGFP-N2连接构建的重组体经酶切和测序,结果与GeneBank报道序列一致。Realtime Q-PCR及Western blotting结果显示,转染pEGFP-PARP-1质粒的细胞其PARP-1在mRNA及蛋白的表达水平均显著高于对照组。结论 PARP-1高表达细胞株成功建立。     

三氯乙烯对豚鼠皮肤致敏作用与肝肾功能的损害

目的 探讨三氯乙烯(TCE)对豚鼠皮肤致敏作用及肝肾功能的损害.方法 采用豚鼠最大值试验(GPMT),将动物分成阴性对照组、阳性对照组和TCE实验组,每组6只豚鼠,分别皮内注射橄榄油、2,4-二硝基氯苯(DNCB)和TCE.实验结束后观察动物皮肤改变,应用自动生化分析仪检测致敏动物血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、白蛋白、球蛋白、乳酸脱氧酶(LDH)、肌苷、尿酸等指标.结果阳性对照组和TCE实验组动物出现明显皮肤红斑、水肿,阳性对照组动物致敏率为100%,TCE实验组动物致敏率为83.3%.阳性对照组动物血清中ALT、AST活力升高,TCE实验组动物血清中ALT、AST、LDH活力明显高于阴性对照组,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论 TCE可诱导豚鼠产生明显的皮肤致敏作用,属强致敏物,并可引起实验动物肝功能指标的改变.     

人胚肺成纤维细胞衰老过程中胰岛素样生长因子2表观遗传活化作用

目的观察体外培养人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中及过氧化氢诱导早衰持续阶段胰岛素样生长因子2(IGF2)表观遗传学修饰。方法荧光定量PCR检测IGF2的mRNA表达,甲基化特异PCR检测其启动子区甲基化改变,染色质免疫沉淀结合定量PCR检测组蛋白修饰,包括组蛋白H3、H4乙酰化,H3(Lys4)及H4(Lys20)甲基化修饰。结果细胞复制性衰老过程中,中年细胞组及复制性衰老细胞组IGF2的mRNA表达升高,早衰持续组升高显著;细胞衰老过程中,仅复制性衰老细胞组在启动子区-658～-456bp具有一定的甲基化水平;复制性衰老细胞组的组蛋白修饰在启动子区-856～-634bp以H4乙酰化,H3甲基化修饰为主;+9～+145bp的修饰,复制性衰老细胞组受组蛋白H3及H4甲基化联合修饰,早衰持续组以H3甲基化修饰为主。结论细胞衰老过程中,IGF2启动子区组蛋白修饰联合调控其mRNA表达,复制性衰老与早衰的调控机制存在差异。