Toll样受体2胞外域及其氨基端和羧基端片段的克隆与序列分析

目的：为研究TLR2胞外域在肽聚糖诱导的信号转导中的功能，构建TLR2胞外域及其氨基端和羧基端片段真核表达载体。方法：提取HL－60细胞总RNA，以RT－PCR方法获取了TLR2胞外域cDNA片段，将其与pGEM-T Easy载体连接，转化E.coli JM109,建立了TLR2胞外域的cDNA克隆；籍此，又相继克隆了胞外域的氨基端和羧基端片段，然后将这三个片段克隆到真核表达载体pcDNA3中。结果：序列分析表明，与GenBank中的人TLR2全长cDNA序列比较，仅4个碱基不同，同源性为0．998。结论：成功获得了HL－60细胞TLR2胞外域及其氨基端和羧基端片段的克隆。     

聚合酶链反应快速检测结核杆菌的临床应用

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)又称体外 DNA 扩增技术或体外核酸克隆技术,自1985年初 Saiki 建立以来,在短短的几年内获得了很大发展。Hance 最先把 PCR 技术应用到结核杆菌的诊断后,国内外相继研究应用。参考国外文献,我们设计合成了一对引物。特异性地扩增结核菌 B 蛋白基     

藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响

目的 表达纯化藤黄微球菌(Micrococcus luteus)复活促进因子(Rpf)及结构域(domain)蛋白,研究其对结核分枝杆菌牛长的影响.方法 诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT-Rpf和pPro-EXHT-Rpf domain,在变性条件下对目的 蛋白进行纯化.用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长.结果 获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95%和93%,相对分子质量(Mr)大小分别为30×103和12×103,蛋白质含量分别为471 mg/L和337 mg/L.Western blot证实,获得的蛋白为我们所需要的目的 蛋白.所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长,而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长.结论 表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长,而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性.     

藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响

目的 表达纯化藤黄微球菌(Micrococcus luteus)复活促进因子(Rpf)及结构域(domain)蛋白,研究其对结核分枝杆菌牛长的影响.方法 诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT-Rpf和pPro-EXHT-Rpf domain,在变性条件下对目的 蛋白进行纯化.用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长.结果 获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95%和93%,相对分子质量(Mr)大小分别为30×103和12×103,蛋白质含量分别为471 mg/L和337 mg/L.Western blot证实,获得的蛋白为我们所需要的目的 蛋白.所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长,而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长.结论 表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长,而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性.     

TTV核酸模板快速制备方法

目的 寻求建立适合大批量临床标本检测TT病毒（TTV）核酸快速制备方法,直接用于PCR扩增。方法 应用蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法与直接快速裂解法,分别制备TTV核酸做PCR模板,用于TTV的聚合酶链反应的快速检测。结果 在30例非甲－非庚型肝炎血清和50例慢性乙型肝炎患血清,应用经典的蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法和直接快速裂解法,分别制备TTV核酸模板,在相同条件下进行PCR扩增,结果两种制备方法的符合率为89％。结论 TTV是一种新发现的肝炎病毒,目前主要以实验室检测病毒核酸的存在为诊断依据,建立了具有快速、简便、适合大批量临床标本中TTV核酸制备方法,对TTV肝炎的快速诊断,具有重要的意义。     

多重聚合酶链反应快速检测脑膜炎中的病原体

目的 建立脑膜炎多重PCR检测系统,以在一次扩增中快速、特异地同时检出新型隐球菌、结核杆菌、脑膜炎双球菌,用于脑膜炎病原体感染的快速诊断。方法 根据新型隐球菌URA保守序列、脑膜炎双球菌基因组中特定的H.8外膜蛋白基因序列、结核分枝杆菌基因组中的IS986插入基因序列片段,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物,采用多重PCR技术,同时检出脑脊液中的新型隐球菌、结核杆菌、脑膜炎双球菌。结果 应用多重PCR反应体系,对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果：我重PCR扩增的预期结果为：单一菌感染出现一条特异性扩增区带;混合感染应出现2条或3条特异性扩增区带,经实验达到预期的扩增结果;对15份已明确诊断的脑脊液标本,分法均能扩增出预期的目的片段。符合率达100%,对20例临床脑脊液标本的PCR扩增结果分别为：新型隐球菌15%（3/20）、结核肝菌20%（5/20）、脑膜炎双球菌10%（2/20）。结论 多重PCR有效地为临床病原体的混合感染,以及原因不明的脑膜炎患的快速诊断,提供了快速、准确的诊断手段。有效地减少了脑膜炎的误诊和漏诊,更提高了检验效率。     

肝素结合血凝素通过抑制A549细胞的自噬作用增强耻垢分枝杆菌的感染能力

目的将肝素结合血凝素(HBHA)重组表达于耻垢分枝杆菌(MS),鉴定其对A549细胞自噬作用的影响。方法将HBHA克隆于穿梭表达质粒pMV261,构建HBHA重组载体,电转化至MS;感染A549细胞,Western blot法鉴定A549细胞微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达情况,并检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的变化可估计自噬的水平;利用单丹磺酰尸胺(MDC)将自噬体染色后,激光共聚焦观察细胞内自噬体变化的情况;通过MS、rMS-HBHA感染A549细胞18 h,计算胞内活菌数,鉴定感染状况。结果 rMS-HBHA经42℃热诱导成功表达HBHA蛋白;相对野生型MS,重组表达HBHA蛋白的MS(rMS-HBHA)可以显著抑制A549细胞中的LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的表达,rMS-HBHA组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值为0.625显著低于MS组2.025,表明rMS-HBHA组自噬体形成受到抑制;并且rMS-HBHA感染A549细胞18 h后胞内活菌为6.3×106,明显高于MS组1×105。结论外源性HBHA可以通过抑制A549细胞的自噬作用增强MS的感染能力。     

链霉亲和素-自噬相关基因融合蛋白的原核表达及纯化

目的 构建链霉亲和素（streptavidin,SA）和自噬相关基因（Beclin 1）重组质粒,并对融合蛋白SA-Beclin 1进行表达和纯化.方法 利用基因重组技术将核心SA与Beclin 1序列连接,克隆人pQE80形成pQE80-SA-Beclin 1重组载体,IPTG诱导融合蛋白原核表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,Western blot鉴定.结果 PCR成功扩增核心SA活性中心,酶切鉴定和测序均证实重组载体pQE80-SA-Beclin 1构建成功;IPTG诱导后SA-Beclin 1融合蛋白（含His标签）在大肠杆菌中高效表达,SDS-PAGE分析表达的融合蛋白以包涵体为主,经镍亲和凝胶层析柱纯化得到融合蛋白,Western blot鉴定其相对分子量约为72000kD,与预期相符.结论 本文成功构建了重组质粒并表达纯化了SA-Beclin 1融合蛋白,为进一步研究SA-Beclin 1的功能及临床应用奠定了基础.     

树突状细胞与超抗原联合诱导抗肿瘤免疫的研究

目的 建立体外培养扩增树突状细胞（DC）的方法，并利用DC和超抗原高聚金葡素（HAS）诱导产生高效特异性抗肿瘤免疫。方法 用GM－CSF和IL－4联合刺激诱导外周血单个核细胞分化为树突状细胞。HAS活化的淋巴细胞称为HASL。将DC与同源淋巴细胞或HASL共培养，分别称为DC－L和DC－HASL。用FCS分析细胞表型，MTT法测定细胞杀伤活性，并观察对裸鼠移植瘤的生长抑制作用。结果 在体外，DC－HASL对GLC－82细胞具有相对特异的杀伤作用，HASL和DC－L则无明显特异性。这三种效应细胞对荷瘤鼠的肿瘤生长都有不同程度的抑制，DC－HASL抗瘤活性最强。结论 将DC和HAS结合可诱导产生一种高效并具有相对特异性的抗肿瘤免疫活性细胞。     

植绒转运拭子联合显色培养基对鼻腔金黄色葡萄球菌定植的快速筛查

目的 采用植绒转运拭子联合显色培养基对鼻腔金黄色葡萄球菌（SA）定植进行快速筛查，了解耳鼻喉头颈外科患者SA定植情况，为预防SA感染和医院感染防控提供依据。方法 采用eSwab植绒转运拭子采集某院耳鼻喉头颈外科门诊患者鼻前庭标本，以WASPLab微生物自动化系统接种于羊血琼脂培养基和MRSA/SA显色培养基，孵育培养16、40 h，自动拍摄、观察菌落，通过质谱（MALDI-TOF MS）、药敏试验和mecA基因检测对SA进行验证。结果 共采集200份鼻前庭标本，检出SA菌株48株，其中MSSA 23株（占47.9%），MRSA 25株（占比52.1%），鼻腔SA定植率为24.0%，MRSA定植率为12.5%。SA筛查阳性报告平均时间为（17.6±6.1）h。培养与质谱鉴定、耐药表型检测的符合率为100.0%，与mecA基因检测的符合率为97.9%。结论 基于植绒转运拭子联合显色培养基的快速检测方法准确度较高，报告时间较短，可以用于SA定植快速筛查。