藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响

目的 表达纯化藤黄微球菌(Micrococcus luteus)复活促进因子(Rpf)及结构域(domain)蛋白,研究其对结核分枝杆菌牛长的影响.方法 诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT-Rpf和pPro-EXHT-Rpf domain,在变性条件下对目的 蛋白进行纯化.用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长.结果 获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95%和93%,相对分子质量(Mr)大小分别为30×103和12×103,蛋白质含量分别为471 mg/L和337 mg/L.Western blot证实,获得的蛋白为我们所需要的目的 蛋白.所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长,而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长.结论 表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长,而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性.     

TTV核酸模板快速制备方法

目的 寻求建立适合大批量临床标本检测TT病毒（TTV）核酸快速制备方法,直接用于PCR扩增。方法 应用蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法与直接快速裂解法,分别制备TTV核酸做PCR模板,用于TTV的聚合酶链反应的快速检测。结果 在30例非甲－非庚型肝炎血清和50例慢性乙型肝炎患血清,应用经典的蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法和直接快速裂解法,分别制备TTV核酸模板,在相同条件下进行PCR扩增,结果两种制备方法的符合率为89％。结论 TTV是一种新发现的肝炎病毒,目前主要以实验室检测病毒核酸的存在为诊断依据,建立了具有快速、简便、适合大批量临床标本中TTV核酸制备方法,对TTV肝炎的快速诊断,具有重要的意义。     

肝素结合血凝素通过抑制A549细胞的自噬作用增强耻垢分枝杆菌的感染能力

目的将肝素结合血凝素(HBHA)重组表达于耻垢分枝杆菌(MS),鉴定其对A549细胞自噬作用的影响。方法将HBHA克隆于穿梭表达质粒pMV261,构建HBHA重组载体,电转化至MS;感染A549细胞,Western blot法鉴定A549细胞微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达情况,并检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的变化可估计自噬的水平;利用单丹磺酰尸胺(MDC)将自噬体染色后,激光共聚焦观察细胞内自噬体变化的情况;通过MS、rMS-HBHA感染A549细胞18 h,计算胞内活菌数,鉴定感染状况。结果 rMS-HBHA经42℃热诱导成功表达HBHA蛋白;相对野生型MS,重组表达HBHA蛋白的MS(rMS-HBHA)可以显著抑制A549细胞中的LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的表达,rMS-HBHA组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值为0.625显著低于MS组2.025,表明rMS-HBHA组自噬体形成受到抑制;并且rMS-HBHA感染A549细胞18 h后胞内活菌为6.3×106,明显高于MS组1×105。结论外源性HBHA可以通过抑制A549细胞的自噬作用增强MS的感染能力。     

链霉亲和素-自噬相关基因融合蛋白的原核表达及纯化

目的 构建链霉亲和素（streptavidin,SA）和自噬相关基因（Beclin 1）重组质粒,并对融合蛋白SA-Beclin 1进行表达和纯化.方法 利用基因重组技术将核心SA与Beclin 1序列连接,克隆人pQE80形成pQE80-SA-Beclin 1重组载体,IPTG诱导融合蛋白原核表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,Western blot鉴定.结果 PCR成功扩增核心SA活性中心,酶切鉴定和测序均证实重组载体pQE80-SA-Beclin 1构建成功;IPTG诱导后SA-Beclin 1融合蛋白（含His标签）在大肠杆菌中高效表达,SDS-PAGE分析表达的融合蛋白以包涵体为主,经镍亲和凝胶层析柱纯化得到融合蛋白,Western blot鉴定其相对分子量约为72000kD,与预期相符.结论 本文成功构建了重组质粒并表达纯化了SA-Beclin 1融合蛋白,为进一步研究SA-Beclin 1的功能及临床应用奠定了基础.     

2种HBsAg定量检测系统对HBV不同感染阶段及不同基因型样本检测的一致性评价

目的分析罗氏MODULAR E170电化学发光免疫分析系统(简称罗氏E170)和雅培i2000化学发光微粒子免疫分析系统(简称雅培i2000)定量检测慢性乙型肝炎不同感染阶段、不同基因型患者的乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)结果的一致性。方法收集临床未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者血清样本共125例,根据《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》中的标准,将样本分为免疫耐受期、免疫清除期、低复制期和再活动期4组,同时根据基因型(B/C)及HBs Ag水平(HBs Ag≤1 000 IU/m L/HBs Ag1 000 IU/m L)分组。用罗氏E170和雅培i2000 2种系统平行检测HBs Ag,分析各组间2种系统检测结果的一致性。结果 2种系统检测结果总体相关性、一致性好(r=0.989,P均0.001);在4个不同感染阶段,2种系统检测结果的相关性好(r值为0.977~0.993,P均0.001);在一致性分析中,免疫清除期、低复制期和再活动期样本检测结果的一致性较好,但在免疫耐受期罗氏E170检测结果较雅培i2000高,偏差为0.114 log IU/m L;B、C基因型组2种系统检测结果的相关性、一致性均好(r值均0.95,P均0.001);在HBs Ag高水平组中,2种系统检测结果的r值为0.959(P0.001),相关性较HBs Ag低水平组略差,但在专业可接受范围内;且在HBs Ag高水平组中,2种系统的偏差较大,罗氏E170检测结果比雅培i2000平均高0.076 log IU/m L。结论 2种系统检测不同感染阶段及不同基因型样本的相关性和一致性较好,但在检测免疫耐受期及高值样本时罗氏E170结果较雅培i2000偏高。临床上用HBs Ag预测抗病毒治疗的效果时,治疗前后应尽量选择同一系统的结果,以避免由于不同系统间的差异造成对治疗效果的错误评估。     

基于PCR-RDB法对陕西地区HCV基因型别的研究

目的 探讨聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)-反向点杂交法(reverse dot blot,RDB)在陕西地区丙型肝炎病毒基因分型中的应用.方法 选取陕西地区610例丙型肝炎患者,利用PCR-RDB法进行丙肝病毒基因型检测,并使用SPSS对检测结果进行统计学分析. 结果 610例丙肝患者检出1b型273例(44.75％),2a型286例(46.89％),3a型30例(4.92％),3b型11例(1.80％),6a型10例(1.64％);各基因型间的患者性别比例的差异具有统计学意义(P＜0.05);与其他基因型别相比,HCV 3a型患者年龄水平最低,差异显著(P＜0.05). 结论 陕西地区丙肝病毒以2a、1b型为主,患者性别及年龄与所感染HCV型别有关联性;PCR-RDB技术在丙型肝炎病毒基因分型中的应用有利于HCV分型在临床上的推广.     

人杀菌/通透性增强蛋白活性片段基因在CHO细胞中的表达

目的获得人杀菌/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)N端活性片段蛋白,为BPI结构和功能的研究提供有力的工具。方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPIN端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染CHO细胞并筛选阳性克隆,免疫荧光法鉴定重组BPI的表达和免疫学活性。结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,与文献报道的序列相比,有6个核苷酸差异。转染筛选的阳性CHO细胞克隆表达产物能够被抗BPI的单克隆抗体所识别。结论BPI活性片段表达载体的构建及真核表达成功,为BPI功能的研究奠定了基础。     

实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌方法的试验研究

目的建立金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR的快速检测方法,探讨该方法的可行性和应用价值。方法根据金黄色葡萄球菌femB基因序列设计引物和探针,采用基因重组技术构建用于金黄色葡萄球菌检测的定量标准品,建立实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌的方法。结果成功构建了金黄色葡萄球菌重组质粒标准品和金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR方法;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性试验,结果表明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性;将模拟标本与分离培养对比,两者符合率为100%。结论金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR检测方法的建立,为金黄色葡萄球菌感染诊断及食源性金黄色葡萄球菌污染的快速检测提供依据,可用于临床感染诊断及食品卫生监管、商品检验检疫等。     

耐药结核分枝杆菌基因突变分析

目的 探讨结核分枝杆菌耐药表型与基因突变位点之间的相互关系.方法 采用序列特异性引物分别扩增92株结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB,异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC,链霉素耐药基因rrs、rpsL,乙胺丁醇耐药基因embB及喹诺酮耐药基因gyrA,SSCP筛选出突变序列,DNA测序分析突变性质.结果 59株利福平耐药株rpoB基因突变检出率94.9%(56/59),以Ser450Trp突变最多;90株异烟肼耐药株中,katG基因突变检出率38.9%(35/90),以Ser315Thr最多,3株检出inhA基因突变,ahpC基因无突变检出;34株喹诺酮耐药株中gyrA基因突变检出率82.4%(28/34),主要为Asp94Gly,其次为Ala90Val;31株链霉素耐药株中,15株检出rrs突变,最常见为A514C和A1041G,10株发生rpsL Lys88Arg突变,总的链霉素基因突变检出率为77.4%(24/31);31株乙胺丁醇耐药株中embB 基因突变检出率19.4%(6/31),主要为Met306Val.结论 耐药结核分枝杆菌耐药情况较为严重,以DNA测序为基础的基因突变分析能快速有效地检测结核分枝杆菌的rpoB、katG、gyrA、rrs、rpsL、embB 等耐药分子标识,显示了西安地区耐药性结核分枝杆菌的突变特点,为结核病的临床诊断和合理用药提供了实验依据.     

5种血清miRNA的检测在前列腺癌诊断中的价值评估

目的 检测miR-141,miR-16,miR-103,miR-574,miR-34b等五种前列腺癌相关的miRNA在前列腺癌患者血清中的含量,评价其在前列腺癌诊断中的价值.方法 收集临床血清样本,将其分为前列腺癌、前列腺增生、PSA升高等三组,提取血清中miRNA.应用荧光定量PCR方法检测相应miRNA的含量,用GraphPad Prism软件进行统计学分析.结果 miRNA-103和miR-34b在前列腺癌患者、前列腺增生患者和PSA增高人群血清中的含量普遍较正常人增高,其中miRNA-34b平均增高2.2×104倍,在所有PSA升高的样本中均增高.其余3种miRNA的水平相对于正常人未呈现显著差异.结论 miR-34b的诊断价值与PSA相当,是一个潜在的前列腺癌诊断性血清标志物.