通过矿化提高蛋白疫苗稳定性的研究

目的:通过原位矿化的方式制备肺炎链球菌蛋白质的磷酸钙矿化颗粒,并评价其在蛋白酶和热处理后的稳定性。方法:通过分子克隆技术表达并纯化蛋白野生型溶血素(WT-PLY)和其无溶血活性突变体(ΔA146PLY),在富含Ca~(2+)和PO_4~(3-)的弱碱性溶液(pH=7.5)中进行生物矿化,制备磷酸钙矿化的蛋白颗粒;通过TEM、FESEM、EDS等分析矿化颗粒的大小、形貌及表面成分;通过抗蛋白酶K降解实验、溶血实验等分析矿化疫苗的稳定性;通过体外细胞实验和体内动物实验评估热处理后矿化蛋白疫苗的保护效应。结果:在1 ml矿化体系中含有360μg蛋白、8.8μmol Ca~(2+)、8.8μmol Mg~(2+)和5.28μmol PO_4~(3-)的条件下,均可制备出WT-PLY和ΔA146PLY的矿化颗粒,BCA检测其包封率分别为44.4%和52.2%;矿化颗粒WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP在蛋白酶K处理15 min内其抗酶解活性高于其可溶性蛋白;矿化颗粒WT-PLY@CaP在55℃处理5 min和45℃处理60 min后,其溶血活性较其可溶性蛋白高;矿化颗粒ΔA146PLY@CaP在55℃处理5 min和45℃处理60 min后仍保持与未处理蛋白一致的免疫活性。结论:生物矿化有助于提高蛋白稳定性。这为疫苗蛋白及其他蛋白制品稳定性的提高提供了一种简便易行的矿化方法。     

肺炎链球菌转化模型的建立

目的:建立一种更加稳定、高效的肺炎链球菌实验室转化模型,以便于对该菌的各种目的基因进行重组改造.方法:分别用改进方法和既往方法制备肺炎链球菌感受态细胞,转化外源DNA,获取发生了转化的菌株,通过抗生素培养基培养和PCR鉴定是否发生转化;并计数抗生素筛选平板上的转化菌落.比较两者的转化率,以确定更佳的转化模型.结果:肺炎链球菌334菌株、31203菌株用改进方法的转化率分别为(0.89±0.20)%,(0.71±0.10)%,高于既往方法的转化率[分别为(6.2±1.4)×10<'-3>%,(5.7±1.1)×10<'-3>%],构建了肺炎链球菌感受态缺陷菌株,建立了改进的肺炎链球菌实验室转化模型.结论:改进的转化模型实现了稳定的肺炎链球菌实验室转化,能方便研究者对该菌进行各种遗传操作,为深入研究其致病的分子机制提供了一个技术平台.     

注重成人学生特点,强化实习教学管理

论述在成人高等医学教育中，根据成人学生的职业化特点，注重实践，注重专业化动手能力的培养。认为，临床实习管理工作针对性要强，特色鲜明，要重视学生实习前专业课学习阶段知识和能力的培养，合理选择实习医院，加强临床生产实习主要环节的管理，只有这样才能提高学生职业素质和职业能力。     

遗传病在法国

作者自 2 0 0 2年 1 1月～ 2 0 0 3年 2月在法国巴黎五大COCHIN医院做了为期 3个月的研修 ,参与了遗传病的实验室诊断及科研工作 ,学习和实践了遗传病诊断与科研的一些新方法 ,亲身感受了医务人员与科研人员认真严谨的工作作风。在此期间 ,正好遇上了法国一年一度专为遗传病罕见病举行的大型募捐活动 ,对遗传病在法国受到的重视程度留下了深刻印象。目前遗传病的研究及诊断工作在我国还只是处于初级阶段 ,有待广大医务工作者和科研人员的共同努力将其提高到一个新的水平。下面是作者在巴黎的一些经历和切身感受 ,希望能引起各级卫生管理…     

《临床检验基础》多维教学模式的构建

建构主义理论的核心是“以学生为中心,强调学生对知识的主动探索、主动发现和对所学知识意义的主动建构”。以此理论为指导,在《临床检验基础》课程中构建基于课堂教学、网络平台和创新实验的三维立体教学模式,使学生在教学活动中不再是被动接受者,而是积极主动的参与者。实践表明,这种模式培养了学生的学习兴趣,同时也提高了学生的自主学习和创新能力以及综合素质。     

肺炎链球菌减毒活疫苗SPY1激发小鼠巨噬细胞应答的免疫作用机制研究

目的 探讨肺炎链球菌减毒活疫苗SPY1对巨噬细胞引起的天然免疫应答及机制。方法 体外诱导培养小鼠骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMDM),SPY1作用巨噬细胞6 h和24 h后,分别用RT-PCR和ELISA检测细胞因子的表达情况;SPY1作用于野生小鼠以及TLR2、TLR4缺陷小鼠的BMDM 24 h后,ELISA检测TNF-α和IL-6的表达;Western blot检测各信号分子的磷酸化水平;MAPK、PI3K和NF-κB抑制剂处理后,检测细胞因子TNF-α和IL-6的表达变化。结果 SPY1作用巨噬细胞后可引起强烈的免疫应答,此过程不依赖于TLR2和TLR4。MAPK、PI3K和NF-κB信号通路参与调控SPY1引起的巨噬细胞天然免疫应答。结论 肺炎链球菌减毒活疫苗SPY1通过MAPK、PI3K和NF-κB通路产生巨噬细胞天然免疫应答,这一过程不依赖于TLR2和TLR4。     

通过替代失活的方法分析核酸片段在肺炎链球菌毒力中的作用

目的 鉴定基因spd-ABC、spd-1672、spd-1673和长间隔序列spd-J在肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)毒力中的作用.方法 采用长臂同源聚合酶链反应(LFH-PCR)的方法分别构建这4个序列的红霉素抗性基因(erm)替代缺失突变体,通过PCR和测序鉴定是否构建成功...     

肺炎链球菌ply基因缺陷菌株的构建及毒力变化的初步研究

目的 构建肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,Sp)溶血素基因(pneumolysin,ply)缺陷菌株,并对其毒力作初步研究,为进一步探索宿主对溶血素的防御应答奠定基础.方法 采用长臂同源多聚酶链反应(LFH-PCR)技术将ply基因替换为红霉素耐药基因(erm)后同源重组于肺炎链球菌,在含红霉素的血平板上筛选出ply缺陷菌株.用PCR鉴定缺陷菌株,观察体外缺陷菌株生长情况,并在小鼠体内感染模型研究其毒力侵袭变化.结果 PCR结果显示ply基因完全被erm基因所替代,构建ply缺陷菌成功;单个菌落培养基生长情况表明ply基因缺陷并未对细菌的体外生长造成影响;但在小鼠鼻腔感染模型中,缺陷菌株入血时间(6 h)明显晚于野生菌株(2 h),且各时间点的菌量均显著低于野生菌株,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01);小鼠腹膜感染模型显示野生菌株半数致死时间为3 d,而缺陷菌株半数致死时间为18d,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 采用LFH-PCR技术作基因突变完全替代ply基因,方法简便快捷;ply的缺陷不影响细菌在体外的生长,但可显著降低细菌在宿主体内的毒力和侵袭.     

PspA免疫小鼠抗肺炎链球菌侵袭性感染研究

目的:获取原核表达的肺炎链球菌PspA重组蛋白并研究其作为疫苗的价值. 方法:分离培养肺炎链球菌TIGR4,获取其染色体DNA,采用基因体外重组法将编码PspA抗原表位在内的部分序列克隆到原核表达载体PET-32(a)内,酶切及测序鉴定重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,将获得的重组蛋白用Western Blot鉴定,镍柱纯化并透析除盐. 用重组蛋白免疫动物,观察PspA抗体对肺炎链球菌感染小鼠的保护作用. 结果:DNA序列与GenBank中的数据相符,所表达纯化的蛋白经Western Blot证实为PspA,其抗体在肺炎链球菌感染中对小鼠有保护作用. 结论:重组PspA刺激产生的抗体能够有效抵抗肺炎链球菌TIGR4侵袭性感染,该重组蛋白可作为肺炎链球菌多肽联合疫苗的组成部分之一.     

实验诊断教学改革探讨

为了提高实验诊断学的教学效果,培养高素质医学人才,我们对实验诊断教学进行了改革,理论课适当补充书本上没有的新进展,注重临床分析问题的培养,加强专业外语的学习。实验课设置与临床一致的实验项目。结果：97医疗系、预防医学系98％学生对这些改革举措满意,并受到同行好评。