单核细胞增生性李斯特菌感染对小鼠骨髓造血干细胞的影响

目的:探究单核细胞增生性李斯特菌感染对小鼠骨髓中造血干/祖细胞(HSPC)组成、细胞周期以及集落形成能力的影响。方法:将C57BL/6J小鼠分为感染组和对照组,感染组小鼠经腹腔注射感染单核细胞增生性李斯特菌6. 7×106CFU,对照组小鼠注射同等体积的PBS。在不同时间点检测小鼠血清中IFNγ水平,24 h后检测小鼠骨髓中HSPC组成、细胞周期以及集落形成能力,统计学处理和分析对照组与感染组之间的差异。结果:感染单核细胞增生性李斯特菌24 h后,血清IFNγ水平达到高峰;与对照组相比,小鼠骨髓细胞中LSK、处于S期的LSK以及短期造血干细胞(ST-HSC)的比例显著升高(P 0. 001),长期造血干细胞(LT-HSC)以及处于S期的LT-HSC的比例明显升高(P 0. 01),骨髓细胞集落形成能力明显降低(P 0. 01)。结论:感染单核细胞增生性李斯特菌后,小鼠骨髓造血干细胞由静止进入增殖状态,细胞集落形成能力下降。这提示,单核细胞增生性李斯特菌感染可引起造血干细胞耗竭。     

放线菌素D/TNF-α诱导大鼠肝干细胞凋亡及HGF的拮抗作用

目的 研究TNF-α、肝细胞生长因子(HGF)在肝干细胞的增殖、分化调控及凋亡中的作用。方法 用大鼠肝干细胞系WB F-344细胞进行实验，用MTT法检测细胞毒作用；用DNA凝胶电泳及流式细胞仪检测细胞凋亡；用Western blot方法检测磷酸化MAPK及PI3K蛋白的表达。结果 发现TNF-α单独对WB F-344细胞无明显作用；而TNF-α对放线菌素D(ActD)致敏的WB F-344细胞有明显细胞毒作用。进一步，发现TNF-α能够诱导ActD致敏的WB F-344细胞发生凋亡，在作用9h即出现细胞凋亡(13．60％)，48h达高峰(51％)，并且这种凋亡呈剂量效应关系。我们还发现，HGF可以明显拮抗ActD／TNF-α诱导的WB F-344细胞凋亡，并且呈剂量效应关系。Western blot结果显示，HGF刺激后，磷酸化MAPK蛋白高表达，表明HGF激活了MAPK途径。我们进一步用PI3K特异的抑制剂WT阻断PI3K途径，发现HGF的抗凋亡作用被阻断；然而，用MAPK特异抑制剂U0126阻断MAPK途径后，却并不影响HGF的抗凋亡作用。结论 TNF-α能诱导ActD致敏的肝干细胞发生凋亡，而HGF则对这种细胞凋亡有明显的拮抗作用；虽然HGF能够激活PI3K及MAPK 2条途径，但其抗凋亡作用是由PI3K途径传导的。     

JNK3重组腺病毒促进表柔比星诱导的人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡

目的:构建人JNK3基因重组腺病毒,检测其对人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖的影响；以表柔比星作为凋亡诱导剂,检测其对细胞凋亡的影响。方法:以pDBLeu-JNK3质粒为模板PCR扩增人JNK3基因全长,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-JNK3,线性化后与骨架载体pAdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组,在HEK293细胞中进行病毒包装和扩增,经PCR方法鉴定后,用包装后的病毒上清感染人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞,Western印迹方法检测JNK3蛋白的表达；MTT实验检测其对细胞增殖的影响；流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳检测表柔比星诱导的细胞凋亡情况。结果:核酸测序和PCR鉴定表明成功构建Ad-JNK3,终点稀释试验测定扩增的腺病毒滴度为6.5×1010 pfu/ml；Ad-JNK3在SH-SY5Y细胞中表达JNK3蛋白；MTT检测结果表明Ad-JNK3可抑制SH-SY5Y细胞生长,抑制率为28.08%；流式细胞术结果表明Ad-JNK3可明显促进表柔比星诱导的细胞凋亡,琼脂糖凝胶电泳可观察到DNA梯形条带。结论:重组腺病毒Ad-JNK3能显著抑制SH-SY5Y细胞增殖,促进表柔比星诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,为研究JNK3的作用机制及将其用于人成神经细胞瘤的基因治疗提供了条件。     

静滴病毒唑致变态反应1倒

1病例报告患儿,男,12岁,主因发热4小时伴全身皮疹就诊于皮肤科。查T38．SC,P80次／min,R24次／min,BP12．7／83kPa。WBC83XIO'／L。无药物过敏史。遵医嘱给予5％葡萄糖30OmL加病毒吐0．Zg静滴,30滴／ffilll,每日1次。患儿输液约5分钟时,突然出现胸闷、心慌且面色潮红,立即停止输液,嘱患儿平卧,吸氧,查T383C,P12o次／min,R28次／min,BP12／skPa,全身可见散在皮疹,面色潮红,双肺呼吸音清,心电图律整率决,10分钟后患儿症状减轻。之后,患儿在兄弟医院再次输病毒吐又出现类似症状,因此确认患儿为静滴病毒吐引起…     

人THAP11慢病毒载体的构建及表达研究

目的 构建人死亡相关蛋白11(THAP11)基因的慢病毒载体,并建立其慢病毒表达系统.方法 PCR方法获得人THAP11基因,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒pBPLV-THAP11-myc,并通过转染HEK293细胞观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达以及Western blot检测其表达.在脂质体介导下将重组质粒与包装质粒pLP1和pLP2、包膜质粒pLP/VSVG共转染293FT细胞包装产生慢病毒.结果 构建的质粒经PCR,酶切及测序鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293FT细胞获取的5.5×106TU/ml慢病毒滴度.结论 成功构建了人THAP11基因慢病毒载体质粒THAP11-myc-pBPLV,并建立了其慢病毒表达系统,为后续的应用研究奠定了基础.     

Tpr-Met转化的Ba/F3稳定株的构建

目的:建立一种可用于高通量筛选c-Met抑制剂的细胞模型.方法:采用电转染将Tpr-Met表达载体导入Ba/F3细胞中并筛选出能够稳定表达Tpr-Met的细胞株.而后对这种稳定株的白细胞介素3(IL-3)非依赖性增殖、Tpr-Met的表达及下游通路的活化、c-Met抑制剂SUl1274对细胞增殖和信号通路的抑制作用进行全面评价.通过酶标仪检测细胞MTS吸光度值判断细胞的增殖水平,通过Western blot法检测Tpr-Met的表达及下游通路的活化、c-Met抑制剂SU11274对细胞信号通路的抑制作用.结果:获得稳定表达Tpr-Met的Ba/F3细胞株,该细胞株呈现IL-3非依赖性生长；能够表达持续活化的Tpr-Met；下游信号通路中关键分子Erk的磷酸化水平显著提升；c-Met特异性抑制剂SU11274通过抑制Tpr-Met磷酸化抑制下游信号通路的活化并抑制稳定株细胞增殖.结论:成功构建了Tpr-Met转化的Ba/F3细胞株.     

人THAP11基因RNAi慢病毒表达系统的建立

目的构建人THAP11基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,制备高滴度病毒颗粒,敲低K562细胞和脐带血CD34＋细胞中THAP11表达。方法采用第三代慢病毒包装系统,将含有特异性干涉THAP11的DNA序列克隆入穿梭质粒pSicoR中,构建siTHAP11-pSicoR质粒。在脂质体介导下,siTHAP11-pSicoR与包装质粒pLP1,pLP2,pLP/VSVG共转染HEK293T细胞,获得高滴度慢病毒颗粒。感染K562细胞,检测内源THAP11敲低效果。感染人CD34＋细胞,流式分选GFP阳性细胞,检测原代细胞中THAP11的敲低效果。结果成功构建针对THAP11两个位点的RNAi慢病毒载体siTHAP11-1和siTHAP11-2并获得慢病毒颗粒,病毒滴度检测可达1.8×108TU/ml。感染K562细胞后建立稳定株,THAP11的蛋白水平和mRNA水平均有下调。感染CD34＋细胞效率达30%以上,siT-HAP11-1可下调THAP11mRNA约80%,siTHAP11-2约下调85%。结论成功构建THAP11的RNAi慢病毒载体,包装后的病毒颗粒可有效敲低细胞株及原代细胞中内源性THAP11的表达,为后续研究THAP11对CD34＋细胞的影响奠定基础。     

敲除BRCC3加重异基因造血干细胞移植受体小鼠急性移植物抗宿主病

目的研究BRCC3的缺失对急性移植物抗宿主病(aGVHD)的影响, 并初步探讨其机制。方法 12只C57BL/6J小鼠作为受体, 分为野生型(WT组)和BRCC3-/-型(KO组), 每组6只。采用两次4.5 Gy60Co全身照射(TBI), 两次照射间隔30 min, 6 h后通过尾静脉输注BABL/c小鼠1×107骨髓细胞和8×106脾脏细胞建立aGVHD小鼠模型。在aGVHD小鼠模型中特异性敲除BRCC3, 通过组织病理学检测靶器官损伤;酶联免疫吸附试验(ELISA)和细胞因子微球检测技术(CBA)检测小鼠血清中细胞因子的水平;移植后第9天分离脾脏、肝脏和小肠淋巴细胞, 运用流式细胞术检测靶器官中T细胞的浸润和活化。结果受体小鼠BRCC3的缺失可导致aGVHD小鼠生存期明显缩短(P<0.05);靶器官肝脏损伤明显加重;脾脏中CD8+ T细胞和CD8+CD25+ T细胞的比例明显升高(t=6.53、5.52, P<0.05);肝脏中CD8+ T细胞和CD8+CD25+ T细胞的比例明显升高(t=3.74、3.19, P<0.05)以及小肠中CD8+ T细胞、CD8...