单核细胞增生性李斯特菌感染对小鼠骨髓造血干细胞的影响

目的:探究单核细胞增生性李斯特菌感染对小鼠骨髓中造血干/祖细胞(HSPC)组成、细胞周期以及集落形成能力的影响。方法:将C57BL/6J小鼠分为感染组和对照组,感染组小鼠经腹腔注射感染单核细胞增生性李斯特菌6. 7×106CFU,对照组小鼠注射同等体积的PBS。在不同时间点检测小鼠血清中IFNγ水平,24 h后检测小鼠骨髓中HSPC组成、细胞周期以及集落形成能力,统计学处理和分析对照组与感染组之间的差异。结果:感染单核细胞增生性李斯特菌24 h后,血清IFNγ水平达到高峰;与对照组相比,小鼠骨髓细胞中LSK、处于S期的LSK以及短期造血干细胞(ST-HSC)的比例显著升高(P 0. 001),长期造血干细胞(LT-HSC)以及处于S期的LT-HSC的比例明显升高(P 0. 01),骨髓细胞集落形成能力明显降低(P 0. 01)。结论:感染单核细胞增生性李斯特菌后,小鼠骨髓造血干细胞由静止进入增殖状态,细胞集落形成能力下降。这提示,单核细胞增生性李斯特菌感染可引起造血干细胞耗竭。     

Tpr-Met转化的Ba/F3稳定株的构建

目的:建立一种可用于高通量筛选c-Met抑制剂的细胞模型.方法:采用电转染将Tpr-Met表达载体导入Ba/F3细胞中并筛选出能够稳定表达Tpr-Met的细胞株.而后对这种稳定株的白细胞介素3(IL-3)非依赖性增殖、Tpr-Met的表达及下游通路的活化、c-Met抑制剂SUl1274对细胞增殖和信号通路的抑制作用进行全面评价.通过酶标仪检测细胞MTS吸光度值判断细胞的增殖水平,通过Western blot法检测Tpr-Met的表达及下游通路的活化、c-Met抑制剂SU11274对细胞信号通路的抑制作用.结果:获得稳定表达Tpr-Met的Ba/F3细胞株,该细胞株呈现IL-3非依赖性生长；能够表达持续活化的Tpr-Met；下游信号通路中关键分子Erk的磷酸化水平显著提升；c-Met特异性抑制剂SU11274通过抑制Tpr-Met磷酸化抑制下游信号通路的活化并抑制稳定株细胞增殖.结论:成功构建了Tpr-Met转化的Ba/F3细胞株.     

HP1γ通过与肝细胞核因子1α相互作用抑制其转录活性

目的初步探讨肝细胞核因子1α（HNF1α）与异染色质蛋白1γ（HP1γ）的相互作用及其功能。方法首先以成人肝cDNA文库为模板,通过聚合酶链反应（PCR）扩增出552 bp的HP1γcDNA片段,然后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1/Myc-HisB,转染HepG2细胞后提取总蛋白进行Western印迹鉴定,进而通过GST沉降实验验证HP1γ与HNF1α的相互作用区段,最后通过荧光素酶报告基因实验HP1γ/HNF1α相互作用的功能。结果通过测序证实真核表达载体Myc-HP1γ构建成功,Western印迹证明Myc-HP1γ可在真核细胞中表达;GST沉降结果表明HP1γ与HNF1α的N端1-189氨基酸相互作用;报告基因实验证明HP1γ抑制HNF1α的转录活性。结论 HP1γ通过与HNF1α相互作用抑制HNF1α的转录活性。     

人THAP11基因RNAi慢病毒表达系统的建立

目的构建人THAP11基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,制备高滴度病毒颗粒,敲低K562细胞和脐带血CD34＋细胞中THAP11表达。方法采用第三代慢病毒包装系统,将含有特异性干涉THAP11的DNA序列克隆入穿梭质粒pSicoR中,构建siTHAP11-pSicoR质粒。在脂质体介导下,siTHAP11-pSicoR与包装质粒pLP1,pLP2,pLP/VSVG共转染HEK293T细胞,获得高滴度慢病毒颗粒。感染K562细胞,检测内源THAP11敲低效果。感染人CD34＋细胞,流式分选GFP阳性细胞,检测原代细胞中THAP11的敲低效果。结果成功构建针对THAP11两个位点的RNAi慢病毒载体siTHAP11-1和siTHAP11-2并获得慢病毒颗粒,病毒滴度检测可达1.8×108TU/ml。感染K562细胞后建立稳定株,THAP11的蛋白水平和mRNA水平均有下调。感染CD34＋细胞效率达30%以上,siT-HAP11-1可下调THAP11mRNA约80%,siTHAP11-2约下调85%。结论成功构建THAP11的RNAi慢病毒载体,包装后的病毒颗粒可有效敲低细胞株及原代细胞中内源性THAP11的表达,为后续研究THAP11对CD34＋细胞的影响奠定基础。     

用EL-4和CTLL细胞测定IL-1RA的活性(简报)

白介素１与免疫细胞表面ＩＬ１Ｒ结合，刺激靶细胞产生ＩＬ２、ＴＮＦ、ＩＬ６、ＩＦＮ和ＧＭＣＳＦ等因子。这些因子在抗感染中既起着重要的免疫调节作用，也是主要的致热原和炎症因子。ＩＬ１基因家族中有３个成员即ＩＬ１α、ＩＬ１β和ＩＬ１ＲＡ，后者的氨基酸序列与前两者不同，但三维结构非常相似，都能与ＩＬ１Ｒ结合。不同的是ＩＬ１ＲＡ与ＩＬ１受体结合只占领位置对细胞无任何刺激作用，故使细胞不再受ＩＬ１刺激。特异性抑制ＩＬ１活性，阻断ＩＬ１引起的炎症反应和组织损伤，降低某些疾病的严重程…     

人THAP11慢病毒载体的构建及表达研究

目的 构建人死亡相关蛋白11(THAP11)基因的慢病毒载体,并建立其慢病毒表达系统.方法 PCR方法获得人THAP11基因,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒pBPLV-THAP11-myc,并通过转染HEK293细胞观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达以及Western blot检测其表达.在脂质体介导下将重组质粒与包装质粒pLP1和pLP2、包膜质粒pLP/VSVG共转染293FT细胞包装产生慢病毒.结果 构建的质粒经PCR,酶切及测序鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293FT细胞获取的5.5×106TU/ml慢病毒滴度.结论 成功构建了人THAP11基因慢病毒载体质粒THAP11-myc-pBPLV,并建立了其慢病毒表达系统,为后续的应用研究奠定了基础.     

放线菌素D/TNF-α诱导大鼠肝干细胞凋亡及HGF的拮抗作用

目的 研究TNF-α、肝细胞生长因子(HGF)在肝干细胞的增殖、分化调控及凋亡中的作用。方法 用大鼠肝干细胞系WB F-344细胞进行实验，用MTT法检测细胞毒作用；用DNA凝胶电泳及流式细胞仪检测细胞凋亡；用Western blot方法检测磷酸化MAPK及PI3K蛋白的表达。结果 发现TNF-α单独对WB F-344细胞无明显作用；而TNF-α对放线菌素D(ActD)致敏的WB F-344细胞有明显细胞毒作用。进一步，发现TNF-α能够诱导ActD致敏的WB F-344细胞发生凋亡，在作用9h即出现细胞凋亡(13．60％)，48h达高峰(51％)，并且这种凋亡呈剂量效应关系。我们还发现，HGF可以明显拮抗ActD／TNF-α诱导的WB F-344细胞凋亡，并且呈剂量效应关系。Western blot结果显示，HGF刺激后，磷酸化MAPK蛋白高表达，表明HGF激活了MAPK途径。我们进一步用PI3K特异的抑制剂WT阻断PI3K途径，发现HGF的抗凋亡作用被阻断；然而，用MAPK特异抑制剂U0126阻断MAPK途径后，却并不影响HGF的抗凋亡作用。结论 TNF-α能诱导ActD致敏的肝干细胞发生凋亡，而HGF则对这种细胞凋亡有明显的拮抗作用；虽然HGF能够激活PI3K及MAPK 2条途径，但其抗凋亡作用是由PI3K途径传导的。