抗HPV_(16)E_6核酶和抗HPV_(18)E_6核酶的设计与表达

以核酶（ribozyme）的锤头结构为模型，采用计算机软件针对HPV16R6、HPV18E6基因，设计了相应的ribozyme（简称抗16HR、抗18HR）。体外合成ribozyme基因后，克隆于带自身修剪功能的原核表达质粒pRG523中，构建成质粒pRG16HR、pGR18HR，为下一步研究抗16HR、抗18HR的体外活性和内效应，从而为探索以ribozyme治疗HPV相关性肿瘤的途经打下基础。     

抗HPV16E6核酶增加宫颈癌CaSKi细胞对顺铂敏感性的研究

目的：研究抗HPV16E6核酶（Ribozyme)导入宫颈癌CaSKi细胞对顺铂（DDP）敏感性的影响。方法：以脂质体法将抗HPV16E6－Ribozyme,空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi-R,CaSKi-P细胞,点穴交检测核酶在细胞中的表达,Northern杂交检测3种细胞中E6基因的表达,检测3种细胞的细胞生长曲线和克隆形成实验,MTT法检测3种细胞对DDP的敏感性,Annexine/PI双标法检测细胞凋亡率,流式细胞术检测Bcl-2,P53,Bax蛋白表达,结果：点杂交证实核酶能在CaS-Ki-R细胞中稳定表达,Northern杂交证实CaSKi-R中表达E6较CaSKi-P,CaSKi明显降低,与CaSKi-P和CaSKi细胞比较,CaSKi-R细胞的生长速率明显减慢和克隆形成率下降,对DDP的敏感性明显增加（P＜0．01）,凋亡率明显增加（P＜0．01）P53,Bax蛋白表达明显增加,Bcl-2蛋白表达明显减少（P＜0．01）,CaSKi-P和CaSKi细胞比较无差异（P＞0．05）,结论：抗HPV16E6－Ribozyme抑制了CaSKi-R细胞的生长和克隆形成率,CaSKi-R细胞对顺铂的敏感性增加。     

日本血吸虫核酸在宿主体内的代谢

目的　为了解日本血吸虫核酸在宿主体内代谢规律 ,寻找快捷、简便的血吸虫病核酸诊断方法提供理论依据。方法　本实验用经体外扩增的日本血吸虫rRNA大亚基核酸片段 ,以不同剂量 2 0、40、6 0、80、10 0 μg经小鼠尾静脉注入小鼠体内 ,在不同的时间 5、10、2 0、30、6 0、12 0min取小鼠肝、全血及血清 ,用PCR方法检测血吸虫核酸片段在小鼠体内的分布及代谢。结果　用特异的rRNA引物对日本血吸虫成虫基因组DNA进行扩增 ,可见一条分子量大小为 2 70bp的扩增带。当注入小鼠体内核酸量大于 80 μg时 ,血清中 5、10min组、肝内 30、6 0min组检测出有血吸虫特异性的核酸片段 ;而 2 0、12 0min肝及血清中均不能检测出血吸虫的特异性片段。白细胞在不同剂量及各个时间点上的PCR结果均为阴性。结论　提示血吸虫核酸在小鼠体内的分布及代谢情况 :血吸虫核酸进入小鼠体内 ,首先是分布在血清中 ,经血液循环后 ,核酸作为异源性物质 ,很快地在肝内进行代谢 ,经一段时间后用PCR方法也检测不到     

Cyclin D1调控U87胶质瘤细胞周期研究

目的探讨细胞周期蛋白D1（Cyclin D1,CCND1）在U87胶质瘤细胞周期调控中的作用。方法根据NCBI GenBank中cyclin D1序列设计双链siRNA,利用Western blotting技术验证设计的siRNA序列的有效性,并通过流式细胞术检测抑制CCND1对U87胶质瘤细胞周期进程的影响。结果经Western blotting检测,成功抑制了CCND1的表达。并且抑制CCND1后,U87细胞周期停滞在G1期,抑制了U87细胞的G1／S期转换。结论U87细胞中抑制CCND1可以显著抑制细胞周期进程,使细胞周期停滞在G0／G1期,为进一步研究胶质瘤的靶向治疗奠定了理论基础。     

实时定量PCR检测小鼠脑组织miR-16家族表达

目的分析小鼠脑组织microRNA-16家族表达谱,为研究miR-16家族及其靶基因在中枢神经系统疾病中的作用提供参考.方法用RNAzol法提取C57BL/6小鼠脑组织总RNA,设计茎环反转录引物,利用半定量qRT-PCR技术对C57BL/6小鼠脑组织中miR-16家族的表达进行分析.结果检测了miR-16家族miRNA中miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195和miR-497在小鼠大脑组织中的表达,发现以小鼠脑组织中miR-15a的表达量作为标准,miR-16的表达水平最高,约为miR-15a表达量的32倍,而miR-195的表达量约为miR-15a表达量的9倍,其余miRNA表达水平均较低.结论本研究采用茎环实时定量RT-PCR法分析了小鼠脑组织中miR-16家族miRNA的表达谱,获得了该家族miRNA在小鼠大脑中的表达数据,将有助于研究中枢神经系统疾病中该家族miRNA的差异表达,并对其功能进行探讨.     

RAPD技术在溪黄草类原植物鉴别中的应用

采用ＲＡＰＤ技术对中药溪黄草类４种原植物进行鉴定研究，结果表明ＲＡＰＤ技术是一种有效的中药鉴定方法，对药材的“地道性”研究有重要意义。     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌细胞免疫学特性影响的研究

目的 研究特异性抗体HPV16E6核酶的转染对宫颈癌细胞免疫学特性的影响。方法 以脂质体法将抗HPV16E6-ribozyme、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi、CaSKi-P细胞。流式细胞仪分别检测3种细胞HLA－1、HL2－2、B7－1和B7－2基因的表达,分析CaSKi细胞转染酶后免疫学特性的变化。诱导制备NK、LAK、CD3AK和肿瘤细胞共激活杀伤细胞,检测各种免疫细胞对CaSKi-R、CaSKi-P、CaSKi细胞的杀伤效应。结果 CaSKi和CaSKi-p细胞中HLA－2、B7－1、B7－2表达都很低,两者差异无显著性。CaSKi-R中HLA－2、B7－1、B7－2表达率均明显升高。3种细胞中HLA－1表达率都很高。NK、LAK、CD3AK细胞对CaSKi-R细胞伤率显著高于CaSKi细胞,CaSKi、CaSKi-R分别与rIL－2共激活杀伤细胞（称CASKI和CASKI－R）的样伤活性无明显差别,对CaSKi-R的杀伤活性高于CaSKi细胞。而各种免疫细胞对CaSKi-P细胞的杀伤率与CaSKi细胞差异无显著性。结论 抗HPV16E6－nrbozyme的导入能使宫颈癌CaSKi细胞易于被机体免疫系统识别杀伤,难于免疫逃避,但不能增强其免疫原性。     

抗HPV16E6核酶和抗HPV18E6核酶的设计与表达

以核酶的锤头结构为模型，采用计算机软件针对ＨＰＶ１６Ｒ６、ＨＰＶ１６Ｅ６基因，设计了相应的ｒｉｂｏｚｙｍｅ。体外合成ｒｉｂｏｚｙｍｅ基因后，克隆于带自身修剪功能的原核质粒ＰＲＧ５２４中，构建成质粒ｐＲＧ１６ＨＲ、ｐＧＲ１８ＨＲ，为下一步研究抗１６ＨＲ，抗１８ＨＲ的体外活性效应，从而为探索以ｒｉｂｏｚｙｍｅ治疗ＨＰＶ相关性肿瘤的途径打下基础。     

杜仲原植物25S rDNA5''端序列分析及其分子识别

目的:为中药杜仲真伪品的鉴别提供新的分子水平的资料。方法:采用末端终止法对中药杜仲大分子rRNA基因(25SrDNA)5’端进行了序列测定。结果:根据序列中核苷酸的变化可有效地鉴别杜仲与其它相关类群。结论:为进一步开展药材杜仲专一性核酸分子探针的研制奠定了基础。     

抗HPV16E_6核酶的原核表达与体外活性研究

目的　获得一种特异性抗人乳头瘤病毒(HPV)16型E6基因的核酶,用以在基因调控水平预防、治疗HPV相关性肿瘤。方法　以核酶(ribozyme,Rz)的锤头结构为模型,采用计算机软件针对HPV16E6基因,设计相应的Rz;体外合成其基因后,克隆于原核表达质粒中。将HPV16E6基因片段也克隆于原核表达质粒中,通过体外转录而得到核酶和病毒mRNA,进行体外切割试验以鉴定核酶的活性。结果　抗HPV16E6核酶(简称抗16HRz)被装入pRG523中而构成pRG16HRz,体外转录后能将核酶独立地释放出来。HPV16E6mRNA转录质粒pTZ16E6含有HPV16E6基因片段( 94位～ 296位),体外切割实验证明抗16HRz具备切割活性,在体外能准确、有效地识别和切割HPV16E6mRNA片段,得到82nt和132nt的切割产物。结论　所获得的抗HPV16E6核酶能特异性切割HPV16E6mRNA,可作为对HPV相关性肿瘤进行基因治疗的工具。