人支气管上皮细胞中苯并芘诱导TNF-α表达的分子机制

目的：构建肿瘤坏死因子-α（TNF-α）启动子双荧光素酶报告基因载体,研究苯并芘（B[a]P）暴露对TNF-αm RNA表达的调控机制。方法：采用Real time-PCR技术检测B[a]P暴露下,人支气管上皮细胞（Beas-2B）中TNF-αm RNA随时间的变化趋势。通过分子克隆技术构建TNF-α启动子双荧光素酶报告基因载体并检测其活性。进一步检测Beas-2B细胞和人肾上皮细胞293T细胞暴露于B[a]P环境下,TNF-α启动子活性的变化趋势。结果：Real time-PCR检测B[a]P暴露下,24 h内,Beas-2B细胞中TNF-αm RNA表达量随时间延长升高。且B[a]P刺激Beas-2B细胞24 h内,TNF-α启动子活性也呈升高趋势。B[a]P刺激293T细胞,TNF-α启动子活性也会升高。结论：成功构建了TNF-α启动子双荧光素酶报告基因载体。而且,B[a]P能够促进TNF-αm RNA的转录从而促进TNF-αm RNA的表达,且promoter1要比promoter2活性强,没有细胞特异性。     

稳定表达SirT7对其转染的P19细胞的增殖抑制作用

目的 构建稳定表达SirT7的P19细胞系并探讨Ⅲ类组蛋白去乙酰基酶SirT7在该细胞中对细胞增殖和细胞周期的影响.方法 将SirT7的真核表达质粒转染进入P19细胞,并利用筛选标记筛选出稳定克隆,采用Western blot、流式细胞仪等方法观察SirT7对P19细胞生长和细胞周期的影响.结果 稳定表达Sirt7 P19 细胞系细胞生长速度减慢,流式细胞仪荧光分析呈现明显的G1/S期阻滞. 结论SirT7可导致P19细胞的周期阻滞,并抑制细胞的增殖.     

单核苷酸多态性位点法对国内近交系小鼠遗传检测

目的利用95个单核苷酸多态性位点(SNP)对29个品系共36个不同群体来源的近交系小鼠进行遗传检测,并分析、鉴别不同品系的位点。方法对来自国内各地的C57BL/6J、BALB/c等36个群体近交系小鼠样品提取DNA后,选取参考自国内外文献的95个SNP位点,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对这些样品进行等位基因型分型,并两两比较等位基因型不同的位点数目。结果共有29个群体(80.56%)的小鼠在95个SNP位点中成功进行了基因分型,有个别群体因为样品质量原因没有实现全部成功分型,主要集中于BALB/c相关背景的3个群体小鼠。被检品系中,大部分位点为纯合位点,品系内位点单态率最高为98.95%。群体两两比较显示,差异等位基因型最多的位点数达到58个,最少的只有1个,主要分布于同一品系不同群体来源的动物间及基因修饰动物和背景动物间。结论所选SNP位点可用于近交系小鼠遗传检测和品系鉴别,但SNP用于近交系遗传检测仍应优化出可代表每一个近交系品系特征的SNP位点组合。     

ND3在自发性糖尿病长爪沙鼠5种组织中的表达

目的 分析糖尿病长爪沙鼠5种组织中ND3基因在mRNA和蛋白水平的表达,以期探索长爪沙鼠糖尿病模型中ND3的作用及其靶器官.方法 选取血糖正常对照组沙鼠和糖尿病实验组沙鼠各6只,分别采集动物的肾脏、肝脏、骨骼肌、脑和心脏组织,采用实时定量PCR和Western blotting方法检测在各组织中ND3 mRNA和ND3蛋白水平表达状况.结果 与对照组动物相比,糖尿病长爪沙鼠ND3 mRNA表达水平在肾脏组织中极显著升高,肝脏和肌肉组织中则显著降低,脑组织中仅有降低趋势,而在心脏组织中仅有升高趋势.检测ND3蛋白水平表明,除心脏组织外,其他组织均与mRNA水平表达结果一致.结论 肾脏组织可能是糖尿病长爪沙鼠ND3基因作用的主要部位,同时在其他4种组织中该基因也发挥着一定作用.     

表皮生长因子受体对苯并芘诱导的人支气管上皮细胞SIRT1活化的影响

目的：探讨表皮生长因子受体（EGFR）在调控苯并芘（B[a]P）诱导人支气管上皮BEAS-2B细胞沉默信息调节因子1（SIRT1）活化中的作用,阐明EGFR/SIRT1信号转导通路与肺癌发生发展的关系。方法：MOTIF Search^TM分析软件预测SIRT1启动子序列上转录DNA结合位点。培养BEAS-2B细胞,设不加苯并芘的细胞为对照组,苯并芘组细胞暴露于苯并茈（8 μmol·L^-1）不同时间（6、12、24和48h）,RT-PCR和蛋白免疫印迹法检测各组细胞中EGFR mRNA和蛋白表达水平。将SIRT1启动子荧光素酶报告载体转染入BEAS-2B细胞中,采用人表皮细胞生长因子（hEGF）和酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein处理细胞24h,倒置显微镜观察各组BEAS-2B细胞形态表现,荧光素酶报告基因技术检测SIRT1荧光素酶活性。收集相关肺组织临床标本,免疫组织化学法检测肺组织中EGFR蛋白表达水平。结果：SIRT1启动子序列上含有表皮细胞生长因子（EGF）、铁氧还蛋白（2Fe-2S）和血管性血友病因子（vWF）3个转录因子的DNA结合位点。与对照组比较,苯并芘组细胞中EGFR mRNA表达水平升高（P < 0.05）,且在12h达到峰值,同时EGFR蛋白表达水平均不同程度升高（P < 0.05）。与对照组比较,hEGF组和苯并芘组BEAS-2B中细胞SIRT1荧光素酶活性明显增加（P < 0.05）,hEGF联合苯并芘组BEAS-2B细胞中SIRT1荧光素酶活性增加更为明显（P < 0.001）;Genistein大于30 μmol·L^-1时,细胞排列逐渐稀疏,形态改变明显;Genistein（30 μmol·L^-1）能够抑制苯并芘诱导的SIRT1荧光素酶活性的增加,与苯并芘组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。免疫组织化学法,肺癌组织中EGFR蛋白表达水平明显高于正常肺组织（P < 0.001）。结论：苯并芘暴露下,EGFR能够促进SIRT1的表达,从而诱导肺慢性炎症反应,EGFR/SIRT1信号转导通路在肺癌的发生发展过程中发挥一定的作用。     

人支气管上皮细胞中苯并芘诱导TNF-α表达的分子机制

目的：构建肿瘤坏死因子-α（TNF-α）启动子双荧光素酶报告基因载体,研究苯并芘（B[a]P）暴露对TNF-α mRNA表达的调控机制。方法：采用Real time-PCR技术检测B[a]P暴露下,人支气管上皮细胞（Beas-2B）中TNF-α mRNA随时间的变化趋势。通过分子克隆技术构建TNF-α启动子双荧光素酶报告基因载体并检测其活性。进一步检测Beas-2B细胞和人肾上皮细胞293T细胞暴露于B[a]P环境下,TNF-α启动子活性的变化趋势。结果：Real time-PCR检测B[a]P暴露下,24 h内,Beas-2B细胞中TNF-α mRNA表达量随时间延长升高。且B[a]P刺激Beas-2B细胞24 h内,TNF-α启动子活性也呈升高趋势。B[a]P刺激293T细胞,TNF-α启动子活性也会升高。结论：成功构建了TNF-α启动子双荧光素酶报告基因载体。而且,B[a]P能够促进TNF-α mRNA的转录从而促进TNF-α mRNA的表达,且promoter1要比promoter2活性强,没有细胞特异性。     

微卫星DNA分析国内24个近交系小鼠遗传状况

目的利用微卫星位点对国内24种近交系小鼠进行遗传状况分析。方法用前期筛选的富含多态性和等位基因数多的30个小鼠微卫星位点,合成荧光标记引物,对近交系小鼠基因组DNA进行PCR的扩增,经STR扫描对各近交系小鼠品系进行基因分型。结果在24个近交系小鼠品系中,有16个品系在品系内在30个位点上均具有相同基因型。而在不同品系间同一位点具有多态性,可初步对不同品系进行鉴别区分。其余品系内个别动物存在多态性。结论所选位点可以参考用于近交系小鼠遗传质量检测分析,并进行初步品系检测鉴定。     

自发性糖尿病长爪沙鼠环氧化酶(COX)-2在三种组织中的表达

目的 研究环氧化酶(COX)-2基因在糖尿病长爪沙鼠3种组织中的表达水平,进一步探索其与长爪沙鼠糖尿病发生和发展的关系.方法 选取糖尿病长爪沙鼠和正常沙鼠各6只,分别采集动物的骨骼肌、肝脏和肾脏组织,用实时PCR和Western blotting检测COX-2基因在各组织中mRNA和蛋白表达水平.结果 实时PCR的结果表明,COX-2基因的mRNA水平在糖尿病组动物的骨骼肌组织中表达与对照组无明显差异,而肝脏和肾脏组织中有表达升高趋势.Western blotting结果显示,糖尿病组COX-2的蛋白水平在肝脏和肾脏组织中存在表达升高趋势,且肾脏具有统计学意义.结论 COX-2在糖尿病长爪沙鼠肝脏和肾脏组织中表达升高,在肾脏组织尤其明显,说明COX-2对长爪沙鼠糖尿病的影响可能发生在肝脏和肾脏组织中.