CD49f剪接异构体在不同细胞系中的表达

目的比较CD49f选择性剪接异构体在人不同来源干细胞以及结肠癌细胞系中的表达,并构建特定异构体过表达载体用于功能研究。方法 RT-PCR及real-time PCR检测CD49f选择性剪接异构体在不同细胞中的表达;分子克隆方法构建各异构体的慢病毒过表达载体;流式细胞计量术、Western blot及real-time PCR检测CD49f各异构体的过表达;Transwell方法检测细胞侵袭能力的改变。结果人胚胎干细胞系H9中表达CD49f异构体B,而上皮类细胞仅表达异构体A;间质细胞中二者均有表达,但异构体A表达多于异构体B;检测的4个结肠癌细胞系中CD49f异构体A和B均有表达,其中HT29和HCT116中以异构体A为主,而HCT8和LoVo中异构体B的表达更为明显。构建的慢病毒表达载体可使HT29中CD49f异构体A和B获得特异性过表达,其中异构体B的过表达使HT29的侵袭能力增加。结论不同类型细胞中CD49f选择性剪接异构体A和B的表达存在显著差异,二者的生物学功能具有差别。     

两种牙科材料对人胚胎干细胞来源成纤维细胞的细胞毒性研究

目的：观察口腔常用材料氢氧化钙（calcium hydroxide,CH）和复合树脂对人胚胎干细胞来源成纤维细胞（embryo body fibroblasts-H9,EBf-H9）、原代培养人牙髓细胞（human dental pulp cells,hDPCs）及小鼠成纤维细胞L929的细胞毒性,探讨使用EBf H9评价牙科材料生物安全性的可行性。方法：诱导人胚胎干细胞（H9）分化为EBf-H9,原代培养hDPCs,并经免疫细胞化学染色鉴定。用细胞计试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）检测比较梯度浓度CH和复合树脂浸提液对EBf-H9、hDPCs和L929细胞的细胞毒性。结果：CH或复合树脂分别作用24 h和48 h（或72 h）之后,L929细胞的存活率显著低于EBf-H9和hDPCs（P<0.05）,但EBf-H9和hDPCs的细胞存活率没有统计学差异（P>0.05）。结论：对于CH和复合树脂的毒性反应,L929细胞与hDPCs有较大差异,EBf-H9比L929细胞更接近hDPCs的反应,提示在牙科材料生物安全性评价中,人胚胎干细胞来源成纤维细胞具有替代现有细胞检测模型的潜力。     

人胚胎干细胞分化为角质形成细胞过程中标志物的表达特点

目的：诱导人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）定向分化为角质形成细胞K-hESCs（keratinocyte derived from human embryonic stem cells）, 并分析诱导过程中K-hESCs不同标志物的表达特点。方法：运用含骨形成蛋白4、维甲酸和N2添加剂的上皮分化培养基直接诱导hESCs分化为K- hESCs,通过染色体核型分析检测K-hESCs核型,通过实时定量PCR检测K-hESCs在分化的不同时期基因的表达及其与原代人牙龈上皮细胞（human gingival epithelial cells,HGECs）、人永生化口腔上皮细胞（human immortalized oral epithelial cells,HIOECs）、人永生化皮肤角质形成细胞HaCaT的基因表达差异;利用免疫组织化学检测不同标志物在K-hESCs的蛋白表达。结果：运用上皮分化培养基成功地诱导hESCs分化为上皮样细胞K-hESCs; K-hESCs核型具有正常46条染色体,无结构异常;K-hESCs中角质形成细胞标志物基因p63的表达明显低于HaCaT细胞（P<0.05）,而与HGECs和HIOECs中的表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论：运用上皮分化培养基可成功诱导hESCs分化为具有正常核型的K-hESCs;标志物的表达特点提示诱导hESCs分化为K-hESCs的过程是从hESCs向单层上皮干细胞分化继而转向复层上皮终末分化发展的趋势,最终得到的K-hESCs类似于单层鳞状上皮干细胞向终末分化初始阶段的角质形成细胞,该阶段的细胞由上皮干细胞静止状态被激活,处于分化初始高增殖活力阶段。     

基于人胚胎干细胞健康安全评价体系的构建

食品、药品、医疗器械和材料、生物制剂以及环境的质量和健康安全是政府和民众十分关注的热点问题。目前国际标准的健康安全评价检测方法以微生物、动物及其细胞作为载体,不能准确反映人类的生物学特征,预测人体心、肝等靶器官毒性及发育毒性的准确率偏低,在技术层面严重制约了人类健康安全的评价和监控。如何建立准确反映人类生物学特征的健康安全评价体系是关系国民健康安全的重大科学问题［1］。 人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）可真实反映人类生物学特征,并利用其无限增殖和定向分化的特点,可达到检测载体的高度标准化,hESCs技术的发展为体外健康安全评价体系的升级提供了有力支持。 由北京大学牵头,联合浙江大学、中国医学科学院整形外科医院和军事医学科学院,与新加坡国立大学合作,我们完成了科技部国际科技合作一期项目“基于人胚胎干细胞健康安全评价新载体的构建”,并就相关研究成果作为科研工作综述进行发表［2］。在此基础上,合作团队顺利完成了二期项目“创建人胚胎干细胞健康安全预测新体系”,取得了系列成果,现综述如下。     

基于人胚胎干细胞健康安全评价新载体的构建

常用的外源性化合物多达6至7万种,均可通过各种途径进入体内损害机体,危害人类健康。现用的国际标准中,健康安全体外评价载体仍采用微生物、动物及人类永生化细胞、肿瘤细胞或原代培养细胞,但微生物和动物不能完全反映人类的生物学特征,肿瘤细胞不是正常健康的细胞,而原代培养细胞非单一来源细胞,无法进行标准化,因此,急需建立新的生物安全性评价的体外模型。     

悬滴培养法维持瘢痕疙瘩成纤维细胞表面标志CD105的表达及其功能

目的 探讨悬滴培养法对维持体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞表面标志的作用,并初步研究CD105调节细胞功能的作用。方法 以耳部瘢痕疙瘩标本3例培养成纤维细胞,将第5代细胞分别常规贴壁培养和悬滴培养1周,对同一患者来源常规培养的第4代(P4)、第5代(P5)以及悬滴培养的第5代细胞(P5HD),采用多色流式细胞仪检测表面标志CD105、CD90、CD73和CD44的表达;并采用Real-time PCR的方法,检测上述表面标志,以及瘢痕疙瘩成纤维细胞相关功能基因CTGF、Col IA1和Col IA2的m RNA表达。结果 流式检测显示CD105+和CD73+CD90+CD105+细胞比例在P4和P5HD组均高于P5组,统计学分析显示有显著性差异,但P4和P5HD组之间无差异;而CD73+、CD90+和CD44+各组细胞比例无差异。Real-time PCR结果显示,各组细胞CD105的m RNA表达与流式结果一致;且各组CTGF和Col IA1表达差异与CD105一致。结论 悬滴培养法有助于维持体外瘢痕疙瘩成纤维细胞CD105,及其与纤维化和胶原合成相应功能基因的表达,从而保持细胞的生物学功能,但机制有待于进一步的研究。     

OCT4异构体在人胚胎干细胞和间充质干细胞中的表达

目的比较OCT4异构体(OCT4A、OCT4B、OCT4B1)及其调控因子在人胚胎干细胞(hESC)和人间充质干细胞(hMSC)中的表达。方法利用RT-PCR、免疫荧光染色、流式细胞分析及体内/外分化实验,鉴定hESC及hMSC的生物学特性;应用real-time PCR、Western blot和流式细胞分析比较OCT4异构体及其转录因子NANOG,SOX2和mRNA结合蛋白LIN28在hESC及hMSC中的表达水平。结果 OCT4异构体mRNA在hESC和hMSC中均有表达,在hESC中的表达显著高于在hMSC中,并以OCT4A的差别最为显著(P0.01);在蛋白水平,hESC表达OCT4A和OCT4B-256aa,hMSC不表达OCT4异构体蛋白。hESC高表达OCT4的调控因子NANOG、SOX2和LIN28;hMSC低表达SOX2,不表达NANOG和LIN28。结论 NANOG、SOX2和LIN28调控OCT4的表达,OCT4异构体在hESC和hMSC中的表达差异提示其可能是不同发育阶段干细胞自我更新和分化潜能等方面差别的主要因素之一。     

不同培养基对骨髓间充质干细胞免疫学特性的影响

目的比较ScienCell(SCI)干细胞培养基和低糖(LG)完全培养基培养下骨髓间充质干细胞(BMSC)的免疫学特性。方法利用流式细胞分析BMSC表面标志物的表达;通过体外成骨和成脂诱导,鉴定BMSC的多向分化能力;应用混合淋巴细胞反应实验,比较SCI组和LG组BMSC的免疫原性及免疫调节功能;采用流式细胞仪分析IFN-γ刺激前后BMSC表面免疫分子的表达情况。结果混合淋巴细胞反应结果显示,两组培养基培养的BMSC均具有低免疫原性和免疫抑制功能,但SCI组单向混合淋巴细胞增殖率显著高于LG组,而两组双向混合淋巴细胞增殖率未见显著差异。流式细胞仪分析结果显示,SCI组BMSC中免疫共刺激因子CD40阳性的细胞比例显著高于LG组,而HLA-DR以及免疫共抑制因子B7-H1和B7-DC阳性细胞比例均显著低于LG组。IFN-γ刺激后可显著上调两组BMSC中HLADR的阳性细胞比例至90%以上。低浓度的IFN-γ(10 U/mL)仅轻微上调LG组BMSCs的CD40的表达水平;而高浓度IFN-γ(1 000 U/mL)可显著提高两组BMSC中CD40和B7-H1的阳性细胞比例,以及SCI组BMSC中B7-DC的阳性细胞比例。结论在体外,含有不同成分的干细胞培养基可改变BMSC免疫分子的表达水平;SCI组BMSC的免疫原性显著高于LG组,但免疫抑制功能两组无明显差异。