新型雌激素受体β信号通路调节因子的分离及鉴定

目的：利用酵母双杂交技术筛选与ERβ相互作用的蛋白，为进一步研究ERβ的功能奠定基础。方法：从乳腺cDNA文库中钓取ERβ-AF1 cDNA，构建诱饵蛋白载体pAS2-1-ERβ—AF1，利用酵母双杂交筛选技术，在乳腺cDNA文库中筛选与ERβ-AF1相互作用的蛋白。将含有pACT2-候选基因的酵母菌与含有pAS2—1-ERp—AF1的酵母菌进行交配实验，利用LacZ报告基因检测ERβ—AF1与候选蛋白之间是否存在相互作用。然后将ERp—AF1和候选蛋白分别构建到pGEx-KG和pET-28a上，并纯化GST-ERβ-AF1和His-侯选蛋白融合蛋白，利用GST沉淀实验进一步验证ERβ-AF1和候选蛋白的体外相互作用。结果：所获取的候选蛋白为CTGF，是CCN多肽家族成员。交配实验表明，CTGF与ERβ-AF1特异相互作用，而不与空载体或BRCT1对照相互作用。GST沉淀实验进一步验证，CTGF与ERβ、ERα均存在相互作用，但与CTGF同源性较高的NOV蛋白却不与ERβ、ERa结合。结论：CTGF和ERβ存在特异的相互作用。     

曲古抑菌素A对乙型肝炎病毒HBx蛋白与组蛋白去乙酰化酶1相互作用的影响

目的 探讨曲古抑菌素A对乙型肝炎病毒HBx蛋白与组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)相互作用的影响. 方法 常规分子克隆技术构建HBx蛋白及HDAC1表达载体,Western blot分别验证蛋白质表达;谷胱甘肽转移酶沉降试验及免疫共沉淀技术分别于体内外验证HBx蛋白与HDAC1存在的相互作用. 结果成功构建了HBx蛋白及HDAC1表达载体,体内外实验均证实HBx蛋白与HDACI间存在相互作用,但HDACI抑制剂曲古抑菌素A不影响两者间相互作用.结论 HBx蛋白以曲古抑菌素A非依赖方式与HDAC1存在相互作用.     

人ERβ AF1融合蛋白的表达及其多克隆抗体制备

目的: 制备雌激素受体β多克隆抗体.方法: 从人乳腺cDNA文库中PCR扩增ERβ AF1结构域(1～144位氨基酸), DNA 重组插入原核表达质粒pGEX-KG, 转化大肠杆菌DH5α, 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-ERβ AF1融合蛋白.纯化后免疫BALB/c小鼠, 制备鼠多抗血清.通过Western blot和免疫组织化学实验鉴定血清特异性和效价.结果: 成功构建了pGEX-KG/ERβ AF1原核表达载体, 转化DH5α后可高效表达融合蛋白GST-ERβ AF1, 免疫产生的ERβ多抗可特异检测ERβ真核表达载体转染人293T细胞及乳腺癌细胞中ERβ的表达.结论: 制备的ER 抗体对ERβ有反应原性, 效价高, 特异性好, 为进一步研究ERβ的生物学功能奠定基础.     

翻译偶联对霍乱毒素A,B亚基比例表达的影响

目的：证实霍乱毒素操纵子Ａ,Ｂ基因间存在翻译联,解释霍乱毒素Ｂ亚基基因表达水平是Ａ亚基５倍的机理。方法;构建了适合翻译调控研究的报告质粒,通过在ｃｔｘＡ基因５’及３’端进行移码突变,研究突变对Ｂ亚基基因表达水平的影响。结果：建立合适的研究霍乱霉素基因翻译调控的系统,在ｃｔｘＡ基因的近Ｃ移码突变后,Ｂ基因的表达水平降低到１／５（８０％）。结论：霍乱霉素Ａ,Ｂ亚基基因间存在翻译联调控,这种调控是霍乱毒     

药物除菌培育无特殊病原体奶母鼠

本实验根据检菌的药敏试验,采取口服单一药物——抗菌素,配合外用过氧乙酸喷雾消毒的方法培育SPF奶母鼠。通过214只小鼠的实验表明,传代净化至第三代,无需服药即可长期保持在SPF状态。粪便,鼻腔分泌物和体表检查,只带两种非致病菌,内脏无菌。此法效果可靠,简便易行。     

霍乱毒素A、B亚基基因比例表达的精确调节

目的;研究乱毒素Ａ亚基基因内部翻译起始序列的翻译起始效率与Ａ亚基基因翻译起始效率的关系。方法：将基因内翻译起始序列合成后克隆到上游含有起始密码和无起始密码的报告质粒中,研究表达水平的差异。结果：在上流起始区（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎ,ＴＩＲ）与报告基因间插入该序列,基因的表达水平提高１倍,当上上游的翻译起始密码由ＡＴＧ突变为ＡＴＣ时,内部翻译起始序列几乎失去起始功     

乙型肝炎病毒X蛋白在不同肝细胞定位及表达的特性

目的探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)在肝细胞的分布特点及蛋白表达的规律。方法常规分子克隆技术构建HBx及其各种突变体的表达载体,Western blot验证HBx蛋白的表达;荧光共聚集扫描技术观察HBx蛋白在肝细胞中的分布特点;谷光甘肽S转移酶(GST)-Sepharose 4B亲和层析方法纯化GST-HBx融合蛋白。结果成功构建了全长HBx及其各种缺失突变体表达载体;HBx蛋白在肝细胞核内均匀分布,在细胞质内呈颗粒状聚集分布; 在优化蛋白表达及纯化条件下,突变体HBx(73～120 aa)的GST融合蛋白极易降解。结论为从蛋白水平探讨HBx 的生物学功能提供了有利的材料。     

人前列腺癌cDNA文库的构建和筛选

目的:PC1基因是与前列腺癌相关的新基因,在雄激素非依赖和转移的前列腺癌晚期细胞系C42中高表达。为了进一步研究PC1基因的功能及作用机制,构建C42细胞的cDNA文库,寻找与前列腺癌相关基因PC1相互作用的蛋白。方法:从前列腺癌细胞系C42中提取总RNA,进而分离poly(A)+RNA,用poly(A)+RNA进行反转录并以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo(dT)为引物进行PCR扩增,得到两端具有同源臂的PCR片段,以此同源臂为基础在酵母中实现同源重组。通过文库片段、线性化的pGADT7Rec和诱饵质粒pGBKT7PC1C共转化酵母AH109菌株,在文库构建的同时进行与PC1相互作用蛋白的筛选;或先将文库片段,线性化的pGADT7Rec转化AH109,再利用AH109和Y187两种酵母菌株的接合生殖进行筛选。最后用Far Western印迹方法进一步从体外论证了PC1蛋白可与自身相互作用形成二聚体。结果:构建了具有基因多样性和库容量足够大的人前列腺癌cDNA文库,双链cDNA片段的长度大小范围为250～5000bp。共转化的效率为4.3×105,重组效率为1.9×106,筛选的克隆数为4.3×105。接合法筛选时的接合效率为32%,筛选的克隆数为1.0×106。筛选到4个与PC1蛋白相互作用的阳性克隆。从体外证明了PC1蛋白可形成二聚体。结论:此文库的多样性和库容量均符合筛选需求。可用于前列腺癌相关基因     

简易SPF实验动物饲育环境的建立

不久前,我们建立了一个小型SPF环境,进行剖腹产术引入动物,还摸索了药物灭菌的规律。那是利用已有条件,在五十平方米的一室内改造建立的一个SPF动物饲育室。一切材料均系国产,耗资共9000元。经初步检测基本符合要求。现将该室情况简介如下。     

不同型Gsα基因缺失体在大肠杆菌中的克隆与表达

在人类的一些肿瘤中已发现存在Gsα基因突变.本研究室在白血病细胞系的研究中发现了Gsα基因的3个缺失突变体以及野生型的Gsα(分别命名为Gsα L-1,500 bp;Gsα L-2,300bp;Gsα L-3,200 bp和Gsα-4,1 200bp),并已在一些急性白血病患者中检测到.为进一步研究这些缺失体的结构、功能和生物学意义,作者将克隆了GsαL-1,GsαL-2和Gsα-4基因的质粒分别转化到大肠杆菌DH5α中,提取DNA,采用特异引物进行PCR扩增,获得相应的目的基因,分别将其克隆到pET22b(+)表达载体上,再转化大肠杆菌进行表达.经培养,取菌体行SDS-PAGE电泳分析.研究结果:3个基因都有相应分子量的蛋白表达,且均以包涵体形式存在.这表明构建的这3个基因确具完整的基因结构,及相应的蛋白表达.本研究为进一步研究它们的功能及其与白血病发生的关系打下了基础.