转基因内皮细胞的构建及其在复合血管上种植的初步研究

目的:为了解决小口径(直径7mm以下)人造血管术后通畅率低下的问题,利用生物-人工复合血管,结合分子生物学手段,将转入血管内皮生长因子(VEGF165)基因的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)种植于复合血管内腔面,为解决此临床难题提供新的思路和手段。材料方法:构建VEGF165真核表达质粒pCI-neo-VEGF165,获得正确的质粒用于转染HUVEC。从中科院购买HUVEC(代号:ECV-304),用脂质体介导法将pCI-neo-VEGF165转入细胞,经G418筛选后,计数阳性克隆,以比较脂质体和质粒在不同比例情况下转染效率的高低。实验组按质粒和脂质体比例的不同分为4组:1μg/3μl;2μg/6μl;2μg/8μl;3μg/12μl。ELISA检测瞬时转染后HUVEC培养上清中VEGF的表达。再将VEGF165基因瞬时转入HUVEC,利用自己设计的旋转培养装置,将细胞均匀地粘附、种植于复合血管内腔面。复合血管是人工材料(聚酯)和生物材料(成纤维细胞长入,胶原形成)有机结合而成,是将包有聚酯网的硅胶棒埋入绵羊背部皮下组织,3个月后取出,抽去硅胶棒而得到的。结果:脂质体转染效率以2μg/8μl组阳性克隆数最多;ELISA测定瞬时转染后HUVEC培养上清中VEGF的表达量为532·5±43·1pg/ml。使用旋转培养装置的细胞均匀地粘附于复合血管,未使用者细胞积聚于血管腔面下部;转入和未转入VEGF165基因的HUVEC在复合血管内腔面覆盖面积百分比分别为69·9%±3·5%、43·7%±2·5%,有明显改善。结论:转入VEGF后可促进HUVEC在复合血管上生长,旋转培养装置有利于细胞的均匀粘附。     

大鼠骨髓内皮祖细胞的分离、培养和鉴定

目的研究大鼠骨髓内皮祖细胞（EPC）分离、培养并向内皮细胞方向诱导分化的方法和条件。方法从大鼠骨髓中分离单个核细胞．经差速贴壁后取二次贴壁细胞选择性诱导培养2W。以Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1双荧光染色法以及vWF、Flk-1免疫荧光染色法鉴定EPC；流式细胞术（FACS）检测EPC纯度；细胞培养液一氧化氮（NO）含量测定分析EPC功能。结果二次贴壁细胞经诱导培养后3d开始伸展，5d形成集落，7～10d增殖加速并出现条索状结构，2W大部分细胞呈多角形。Dil—ac—LDL、FITC-UEA-1双染．vWF及Flk-1免疫荧光染色阳性率均〉70％。FACS检测其中vWF阳性细胞占77．93％．Flk-1阳性细胞占81．50％。二次贴壁并经诱导培养的细胞培养液中NO含量明显高于普通培养的细胞．但低于成熟内皮细胞（P〈0．05）。结论大鼠骨髓富含EPC，体外诱导培养后可以表现出内皮细胞的部分特征。     

心肌梗死微环境中氧化低密度脂蛋白对树突状细胞诱导炎症反应的影响

目的：体外模拟高脂血症小鼠心肌梗死（myocardial infarction, MI）和肾素-血管紧张素系统（RAS）被激活的内环境,研究氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）能否在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的基础上进一步诱导树突状细胞（dendritic cells, DCs）的成熟、迁移和炎症反应,并探讨可能参与其中的信号通路。方法：诱导C57BL/6J小鼠骨髓细胞分化成DCs,然后加入坏死心肌细胞上清,分别给予AngⅡ和ox-LDL+AngⅡ干预48 h。流式细胞仪检测DCs的成熟标志物（CD83）和协同共刺激分子（CD86）的表达,用qPCR、ELISA方法测定炎性因子的表达。Western 印迹法检测核因子κB（NF-κB）和IκB磷酸化程度,以及血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）和Toll样受体（TLR）4信号通路的表达。结果：ox-LDL能够在AngⅡ基础上进一步诱导CD83和CD86的表达,增强炎性因子和趋化因子的表达,增强NF-κB和IκB磷酸化程度（P<0.05）。ox-LDL能够在AngⅡ基础上进一步上调LOX-1的表达,同时激活了TLR4-MyD88-NF-κB通路（P<0.05）。结论：ox-LDL可能在AngⅡ的基础上进一步诱导DCs免疫成熟、迁移和炎症反应;LOX-1-TLR4-MyD88-NF-κB信号通路可能参与DCs成熟,以及DCs在高脂血症合并心肌梗死发生和发展中引起炎症反应的过程。     

芪苈强心提取物对缺氧大鼠心肌微血管内皮细胞VEGF及HIF-1α表达作用的研究

目的观察芪苈强心提取物对缺氧诱导的大鼠心肌微血管内皮细胞VEGF及其上游调控因子HIF-1α表达的影响,探讨芪苈强心胶囊抗心力衰竭作用的相关机制。方法植块法培养2周龄SD大鼠心肌微血管内皮细胞并鉴定,传代后将第二代细胞随机分为三组：空白对照组,缺氧干预组,缺氧干预＋芪苈强心组。干预6h后收集细胞上清,提取细胞核蛋白及胞浆蛋白,利用ELISA,WesternBlot分别检测细胞上清液中VEGF含量及细胞内VEGF上游调控因子HIF-1α的表达。结果与对照组比较,缺氧干预组心肌微血管内皮细胞VEGF、HIF-1α表达增加,与缺氧干预组比较,芪苈强心干预组VEGF含量均进一步升高,HIF-1α也表现出相同趋势。结论芪苈强心提取物能够通过促进缺氧状态下心肌微血管内皮细胞HIF-1α诱导的VEGF表达,这可能是芪苈强心发挥抗心力衰竭作用的机制之一。     

梗死心肌弹性模量与心肌结构及功能的时间依赖性相关变化

目的 探讨BALB/c小鼠心肌梗死（MI）后弹性模量与心肌结构和心功能的相关变化。方法 分别于小鼠MI后1小时、24小时、7天、14天和28天,行心脏功能和左心室腔内压力检测;应用原子力显微镜检测梗死心肌弹性模量;梗死心脏组织制成石蜡切片行苏木素-伊红染色和Mallary纤维染色。结果 （1）梗死后心肌弹性模量呈现先降低后逐渐增高的时间依赖性变化。（2）组织病理染色显示,心脏结构与心肌弹性的变化在时间上呈对应关系。（3）心肌梗死后心脏功能和左心室腔内压力的改变表现出与上述理化参数相似的变化趋势。结论 小鼠心肌梗死后弹性模量、心肌结构和功能均表现出时间依赖性相关变化且相互之间保持高度的一致性。     

Wnt信号参与压力超负荷诱导的小鼠心力衰竭过程

目的通过检测wnt11、WIF-1及β-catenin在压力超负荷心力衰竭小鼠中的表达探索wnt信号在心力衰竭发生过程中的作用。方法主动脉缩窄法（transverse aortic constriction,TAC）建立C57/BL6小鼠心衰模型,假手术组为对照组。彩色多普勒采集心脏指标,取建模前后的血浆样本及心肌样本,测定血液中wnt11、WIF-1浓度及心肌组织中wnt11、WIF-1及β-catenin表达情况。结果与假手术组比较,TAC组小鼠wnt11、β-catenin的表达明显高于假手术组,而WIF-1的表达明显下降。结论 wnt途径信号分子参与压力超负荷介导的心力衰竭发生发展过程,相关生物标记物可能对心力衰竭的治疗有指导意义。     

热休克转录因子1在心肌及其他组织中的抗炎作用

人类的热休克转录因子1（HSF1）在多个器官组织中均有表达，参与调节热休克反应、诱导热休克蛋白的表达。它具有多种生物学功能，不仅能抗凋亡、保护缺血心肌细胞、抑制心肌纤维化、参与生长发育过程；而且还能对抗炎症反应，在心肌细胞炎症反应、肺部损伤和感染、内毒素血症、全身炎症反应综合征及其他炎症相关性疾病中发挥着举足轻重的作用。本文结合热休克反应和热休克蛋白，就HSF1在不同组织和病理过程中的抗炎作用、与各种炎性介质的关系及其相互作用的机制作一综述。     

铊^201单光子发射计算机断层心肌显像对隐匿性冠心病预后判断的价值

目的探讨心肌潘生丁负荷／再分布铊（T1）^201单光子发射计算机断层显像（single photon emission computed tomography，SPECT）法评价隐匿性冠心病预后的可行性。方法入选1998至2005年期间94例无任何症状但运动平板试验反复阳性的飞行人员，根据SPECT心肌显像结果分为检查结果阳性组及阴性组，阳性组中根据心肌缺血累及范围又分为单个节段受累亚组、2个节段受累亚组和2个以上节段受累亚组，平均随访4．5年，比较组间的主要心血管事件（major adverse cardiovascular events，MACE）发生率。结果随访过程中，阳性组与阴性组的MACE分别为30％与7％，差异具有统计学意义（P〈0．01）。2个以上节段受累亚组组MACE发生率（100％）明显高于单个节段受累亚组（24％）、2个节段受累亚组（22％）及阴性组（7％），P均〈0．05。结论潘生丁负荷心肌T1^201-SPECT显像有助于隐匿性冠心病预后判断，从而指导临床早期干预治疗。     

两次骨髓干细胞移植治疗大面积急性心肌梗死的疗效观察

目的探讨两次细胞移植治疗大面积心肌梗死患者的疗效。方法35例大面积急性心肌梗死患者(LVEF<40％),成功实施急诊PCI术后3-7 d,行uRI及SPECT后,随机分为3组。A组11例单次细胞移植组患者于PCI术后3-7 d施行细胞移植,B组12例两次细胞移植组患者分别于PCI术后3-7 d及术后3个月接受细胞移植, 12例对照组患者在相同时间接受0．9％氯化钠溶液冠脉内注射。结果随访12个月时,未发现与重复细胞移植相关的不良反应。MRI结果发现,与对照组相比,单次移植组和两次移植组LVEFF变化值均显著升高[(2．9±2．0)％比(7．1±1．5)％比(11．7±2．7)％,P<0．01],而两次移植组较单次移植组变化更为显著(P<0．01)。同时,MRI显示两次移植组梗死心肌面积、SPECT显示心肌灌注面积改善幅度均优于其他两组(P<0．01)。结论两次骨髓干细胞移植治疗对于大面积急性心肌梗死患者是安全可行的,可在一次移植的基础上进一步改善心脏功能。     

SHU555A标记间充质千细胞心肌内磁共振成像的策略优化

目的目前研究表明,超顺磁性氧化铁颗粒标记干细胞后,可进行心肌内移植磁共振活体示踪,但由于标记效率较低,加上大动物心电门控和呼吸控制效果较差,磁共振图像质量差强人意。本实验采用SHU555A(Resovist)纳米微粒标记猪骨髓间充质干细胞(MSCs),对标记方法和标记细胞磁共振成像进行方法学优化,以期提高磁共振成像质量。方法①细胞磁标记方法的优化:分离培养猪MSCs。将SHU555A和非特异性转染剂PLL以1:0．03的比例用无血清的DMEM培养液稀释,制成含铁终浓度分别为0、25、50、100和200 g／mL的SHU555A-PLL标记培养液,室温下轻摇混合60 min,形成SHU555A-PLL复合物,标记猪MSCs 24 h以确定最佳标记浓度;然后以该浓度与猪MSCs分别共孵育0、2、4、8、16、24和48 h,以确定最佳标记时间。反映不同条件下标记效率和标记毒性的检测指标包括:普鲁士蓝染色、细胞电子显微镜检查、细胞铁浓度测定(原子吸收分光光度仪)、锥虫蓝排除试验、细胞毒性和增殖活性测定(CCK-8试验)。②标记细胞心脏移植的磁共振成像优化:开胸结扎前降支建立猪急性心肌梗死模型10头,每头直视下经心外膜向左室梗死交界区心肌内缓慢注射(1-10)×106细胞,每点150μL,共3点。对植入猪心肌内的标记细胞进行体内磁共振成像。比较T2 * WI-Flash2d(快速小角度反转梯度回波序列)、T2*WI-MAP和钆喷酸葡胺静脉注射后T2*WI-Flash2d等3种成像方法的图像质量。结果①MSCs平均含铁量随着培养液中SHU555A浓度的增加而升高;但SHU555A浓度增加到100 g／mL时,细胞活力开始下降(P<0．01),并可见较多蓝染铁颗粒粘附于细胞表面甚至游离于细胞外;进一步增加到200 g／mL时,细胞存活率和细胞活力均下降(P分别<0．05、0．01)。MSCs平均含铁量随着共孵育时间的增加而相应升高:但共孵育48 h时,细胞存活率降低(P<0．05)。电子显微镜检查显示, 50:1．5μg／mL SHU555A-PLL 24 h标记方案在细胞和亚细胞水平未发现氧化铁的毒性作用。该方案体外磁共振T2*WI-GRE检测闽值为7．5×104细胞。②标记细胞心肌内移植磁共振成像发现,T2*WI-Flash2d图像平均评分为(2．00±0．82)分;72*WI-Map成像、钆喷酸葡胺注射后T2*WI-Flash2d图像平均评分均为(2．60±0．84)分,明显优于前者(P=0．024)。结论50:1．5μg／mL SHU555A-PLL培养液与猪MSCs共孵育24 h是合适的标记方案。1．5 T磁共振成像仪72*WI-Flash2df笋列可对植入心脏的磁标细胞进行活体显像,T2*I-Map成像、钆喷酸葡胺注射后T2*WI-Flash2d成像可显著提高图像质量。