半巢式RT-PCR法检测呼吸道合胞病毒

目的建立快速、敏感、特异的人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)检测方法。方法根据RSVF基因的保守序列设计3条引物，建立半巢式RT-PCR(semi-nested RT-PCR)检测方法。用该方法检测125例患急性下呼吸道感染的婴幼儿的鼻咽吸引物(nasopharyngeal aspirates，NPA)标本，同时对标本进行病毒分离和直接免疫荧光法检测。结果该半巢式RT-PCR灵敏度为0．1TCID50，用该方法在125例标本中共检出RSV阳性标本63例，阳性率50．4％。结论建立快速、敏感、特异的RSV半巢式RT-PCR检测方法，该方法适用于临床早期诊断和流行病学监测。     

汉坦病毒N蛋白的重组表达及其用于IgM直接捕捉ELISA的建立和应用

目的克隆并表达汉坦病毒（HV）Z10株（HV—Z10）N蛋白（NP）编码基因，建立基于辣根过氧化酶（HRP）标记重组NP（rNP）的rNP—IgM直接捕捉ELISA，检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清并评价其检测效果。方法PCR扩增HV—Z10株NP编码基因，基因工程方法构建NP编码基因原核表达系统pET28a—Z10N—E．coli BL21DE3。SDS-PAGE了解rNP表达情况，离子交换法和Ni—NTA亲和层析法提纯rNP。Western blot检测rNP的特异性免疫反应性。建立HRP标记rNP—IgM直接捕捉ELISA检测HFRS患者血清样品，并与常规HV—IgM间接捕捉ELISA进行比较。结果pET28a—Z10N—E．coli BL21DE3高效表达rNP。提纯rNPSDS-PAGE显示单一蛋白条带，HV-IgG能有效识别rNP并与之结合。94．73％（90／95）HFRS患者血清样品rNP—IgM直接捕捉ELISA检测结果阳性，HV—IgM间接捕捉ELISA阳性率为92．63％（88／95）。两种IgM捕捉ELISAs检测的HFRS患者血清样品A450值分布及对多份不同稀释度血清检测的A450，均值变化均相似。结论成功构建了HV—Z10株NP编码基因高效原核表达系统。所建立的rNP—IgM直接捕捉ELISA可作为HFRS简便、安全、敏感、特异的血清学诊断新方法。     

肾综合征出血热病毒高效价免疫血清抗体毒株的筛选

肾综合征出血热（HFRS）是由布尼亚病毒科汉坦病毒属引起的急性传染病。在HFRS病毒和疫苗的研究工作中，常采用间接免疫荧光抗体（IFA）技术和直接荧光抗体（FA）技术。利用高效价兔抗HFRS病毒免疫血清制备的荧光血清在检测HFRS病毒抗原：亡作中，具有特异、快速的优点忙，而荧光血清的质量与免疫血清的效价有直接关系，不同生物学特性的HFRS毒株免疫敏感动物家兔后，其免疫血清的效价有一定的差异。因此，能产生高效价免疫血清的毒株筛选是制备高质量荧光血清的关键。     

MRP1在大肠癌中表达的研究

目的研究多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein1,MRP1)在大肠癌中的表达及其与临床病理指标的关系,为大肠癌的有效防治提供科学依据。方法应用免疫组织化学SP法对53例大肠癌患者的原发灶癌组织、距原发灶10cm经病理证实的正常组织进行MRP1蛋白免疫组织化学检测,并将检测结果与患者的年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移、肿瘤浸润深度、分化程度、生长部位、Dukes分期情况进行综合分析。结果MRP1蛋白主要是在细胞膜和(或)细胞浆内表达,MRP1蛋白在大肠癌原发灶组、正常组织组的阳性表达率分别为49.1%(26/53)和15.1%(8/53),两者有显著性差异(P<0.01)。MRP1的表达与大肠癌组织的分化程度、浸润深度、淋巴结转移等病理特征均无关。结论MRP1可能与大肠癌的发生有关,并与原发性多药耐药性有关,MRP1可能是独立于病理学特征之外的分子参数。     

II型登革病毒NS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

目的获得II型登革热病毒NS1基因并在昆虫细胞中表达,为进一步研发登革热血清学检测试剂盒提供抗原。方法RT-PCR扩增II型登革热病毒NS1基因并测序列,并定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBac-NS1。并将pFastBac-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1。在脂质体介导下将rBacmid-NS1转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-NS1。rBV-NS1感染Sf9细胞后,通过SDS-PAG和Western blot检测NS1重组蛋白。结果成功克隆II型登革病毒NS1基因,SDS-PAGE、间接免疫荧光和Western blot检测表明NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与登革患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性。结论II型登革病毒非结构蛋白NS1在昆虫中表达,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定基础。     

响应面分析法优化黄芩总黄酮提取工艺的研究

目的优选超声波法提取黄芩总黄酮的工艺条件,为工业化生产黄芩总黄酮提供参考。方法采用超声波法提取黄芩总黄酮,对使用Al（NO3）3-NaNO2显色法测定黄芩总黄酮进行方法学考察;选取乙醇浓度、液固比、提取时间3个影响因素进行BoxBenhnken中心组合设计,利用响应面分析法（RSM）对提取工艺参数进行优化。结果方法学考察结果表明本实验室采用Al（NO3）3-NaNO2显色法测定黄芩总黄酮及超声提取工艺可靠;提取黄芩总黄酮最佳提取工艺为：乙醇浓度60%,液固比40mL/g,提取时间45min;预测值为1.776%,实际得率为1.704%,两者吻合度较高。结论 Box-Benhnken设计结合响应面分析法对黄芩总黄酮提取工艺进行优化既方便又快捷,得出的参数可信度高、实用性好。     

浙江新分离汉坦病毒ZT71株S基因片段的克隆及序列分析

目的为了获得浙江省汉坦病毒基因组更为详尽的资料,研究汉坦病毒的进化状况及变异程度,为疫苗病毒株的选择使用提供科学依据。方法本实验室利用RT-PCR方法扩增ZT71株S基因片段并克隆入质粒载体,进行核苷酸序列测定及分析。结果ZT71株S基因由1754个核苷酸组成,只有一个开放读码框架,共编码429个氨基酸。与HTN型病毒(76-118)的核苷酸和氨基酸同源性分别为72.0%和82.6%,与SEO型病毒(SR-11、R22、Guo3、8610)核苷酸和氨基酸同源性分别为88.4%—96.5%和98.1%—99.0%,与其它型汉坦病毒的同源都很低。结论表明此分离的病毒为SEO型汉坦病毒,为进一步研究其进化和变异提供了有利条件。     

2007年浙江省鼠类感染汉坦病毒监测及病毒分离

目的了解浙江省鼠类自然感染汉坦病毒（HV）情况和病毒型别,为肾综合征出血热（HFRS）防治提供科学依据。方法采集鼠类肺组织和血清标本,用间接免疫荧光试验检测鼠血清IgG抗体,直接免疫荧光试验检测鼠肺Hv抗原。HV抗原阳性鼠肺接种Vero—E6细胞分离病毒,用HV单克隆荧光抗体鉴定分离株的型别。结果共捕获鼠形动物1129只,其中黑线姬鼠为优势种,鼠肺HV抗原阳性率为3．0％,鼠血标本IgG抗体阳性57份,阳性率8．0％。分离到6株汉滩（HTN）型病毒,其中来自黑线姬鼠5株,褐家鼠1株。结论浙江省存在以黑线姬鼠为主要传染源的HFRS疫源地,HV主要流行型别为HTN型。     

浙江省蚊媒携带流行性乙型脑炎病毒的分布特点

目的 了解浙江部分地区蚊媒及猪携带流行性乙型脑炎(乙脑)病毒情况以及浙江省存在的乙脑病毒基因型别.方法 于2007年5月至10月在浙江省仙居、龙泉和慈溪3个县人房及猪舍采集蚊虫标本和猪血清,共采集10 662只蚊虫和204份猪血清,蚊虫标本中以淡色库蚊和中华按蚊为主.利用病毒分离和荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测蚊虫携带乙脑病毒,应用酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)方法对猪血清进行抗体检测.应用荧光定量RT-PCR方法对细胞分离株进行病毒鉴定;利用RT-PCR方法扩增新分离乙脑病毒PrM基因,并对细胞分离到的病毒进行基因分型.结果 在蚊虫标本中检出7批乙脑病毒核酸阳性样本,并分离出3株病毒,经鉴定3株病毒均为乙脑病毒,基因分析表明3株病毒均属于基因Ⅰ型乙脑病毒.猪血清有121份阳性,总阳性率为59.3%.6月份有50%以上的猪血清中乙脑病毒抗体呈阳性.结论 浙江省部分地区存在着乙脑的传播媒介,在蚊媒和猪中携带有乙脑病毒;采集的蚊虫标本中分离到3株病毒,经鉴定为基因Ⅰ型乙脑病毒,是近年来在浙江省首次分离到的基因Ⅰ型乙脑病毒.     

一步法流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量反转录聚合酶链反应方法的建立及应用

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的荧光定鼍RT-PCR方法.方法 根据GenBank登录的乙脑病毒毒株序列,应用生物软件在乙脑病毒基因的保守区设计与筛选引物和探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性和重复性.并通过对蚊虫样本的检测,以评价该方法的实际应用价值.结果 优化结果表明荧光定量RT-PCR的最佳反应体系为0.1 μmol/L探针浓度,0.2μmol/L引物浓度,5 mmol/L Mg2+浓度.结果 表明该方法对乙脑病毒的检测有高度的特异性、通用性,对1～4型登革热病毒、狂犬病毒、汉坦病毒(SEO型与HTN型)均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1 TCID50,重复性分析表明同一样品Gt值的重复检测4次,其标准差均在合理范围内,分别为0.033、0.079、0.149和0.411.对110批蚊虫标本进行荧光定量RT-PCR检测和病毒分离榆测,结果荧光定量RT-PCR检测出7份阳性,而病毒分离则只检测出3份阳性,表明建立的荧光定量RT-PCR方法更敏感,可直接从蚊虫样本中检测乙脑病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右,且操作简便、敏感性高.结论 研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于乙脑病原学的快速检测.