脂肪细胞新蛋白My027原核表达、纯化及生物活性研究

目的通过原核表达获得大量脂肪新蛋白质My027,并在体外初步研究其生物活性。方法RT-PCR法扩增出My027片段,插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建质粒pGEX-My027。转化BL-21菌,IPTG低温诱导表达融合蛋白,经亲和层析法获得融合蛋白,利用SDS-PAGE、Western印迹及质谱进行鉴定。在还原性谷胱甘肽存在的条件下,将纯化得到的融合蛋白作用于乙二醛酶Ⅰ的底物甲基乙二醛,通过分光光度法检测产物乳酸谷胱甘肽的生成。结果融合蛋白以水溶形式分泌于大肠埃希菌BL-21胞浆中,纯化后的目的蛋白SDS-PAGE、Western印迹及质谱证实高效表达,氨基酸序列正确。结论人脂肪细胞新蛋白质My027在pGEX-4T-2原核表达载体中可获高效表达,所纯化蛋白具有类似于乙二醛酶Ⅰ的作用。     

人外周血淋巴细胞核甲状腺激素受体测定及初步临床研究

本文用受体放射分析技术,建立人外周血淋巴细胞核T_3、T_4和rT_3受体测定法,并探讨其与甲状腺功能的关系。分离人外周血淋巴细胞采用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法。受体结合试验采用完整细胞分别与~(125)I-T_3、~(125)I-T_4、~(125)I-rT_3温育的方法,用0.0075％TritonX-100 SMT pH7.85溶液分离核,用Scatchard法分析受体结合的解离常数(Kd)和最大结合容量(MBC)。     

健康男性血浆kisspeptin与迟发性性腺功能减退关系研究

目的探讨健康男性血浆kisspeptin与更年期发生的关系。方法对上海市宝山区99名健康志愿者进行PADAM问卷调查、外周血激素测定,分析血浆kisspeptin与年龄、更年期发生及激素间的关系。结果成年男性99名血浆kisspeptin随年龄增加而增长,PADAM症状阳性率也随年龄增高。PADAM症状阳性组与阴性组间年龄差异有统计学意义(P<0.01),而kisspeptin差异无统计学意义(P>0.05)。血浆kisspeptin与年龄(P<0.01)、雌二醇(E2)(P=0.039)密切相关,年龄是血浆kisspeptin变化的重要影响因素(P=0.004)。结论血浆kisspeptin与更年期发生无明显关系,提示成年后kisspeptin在HPG轴中的作用可能不及青春期启动时重要。     

受血糖调控的定点突变胰岛素原真核表达载体的构建

目的构建受血糖调控的含葡萄糖-6-磷酸酶(G6p)启动子的定点突变胰岛素原基因真核表达载体.方法应用基因突变技术(重叠延伸拼接法)改变胰岛素原C肽两端的氨基酸序列,使之能被存在于大多数细胞中的furin酶所识别并剪切为成熟的胰岛素,新序列命名为INS/furin;应用基因重组技术将G6p启动子序列替代真核表达载体pIRES中的CMV启动子序列,并将INS/furin亚克隆至pIRES的多克隆位点B.结果SgfⅠ和Sac Ⅰ、XbaⅠ和NotⅠ两种组合的双酶切及特定引物测序均证实载体构建成功.结论带有G6p启动子的含定点突变胰岛素原基因的真核表达载体有望成为糖尿病基因治疗理想的候选载体.     

染色体20q13区域SNP与中国人2型糖尿病的相关性

目的采用单核苷酸多态性(SNP)标记,在以往所发现的中国汉族2型糖尿病相关基因定位区域(20q13)内寻找疾病易感基因位点。方法选取70例散发糖尿病病人及其正常配偶作为研究对象,通过生物信息学方法在公共SNP数据库中查找定位区域内11个候选基因的21个SNP位点,用等位基因专一性实时PCR方法进行分型,并做病例—配偶对照关联分析。结果21个SNP中有8个在中国人群中为常见SNP位点。病例—配偶对照关联分析结果显示,PRex1基因的SNP位点rs3936192的等位基因频率在2型糖尿病组和正常对照组间有显著性差异(P=0．0280)。结论上述SNP位点可能与中国汉族2型糖尿病相关,为进一步研究这一位点所在的基因与2型糖尿病的关系提供了理论依据。     

瘦素受体基因变异与中国人肥胖的关系

目的研究瘦素受体基因变异与中国人肥胖的关系.方法选择肥胖病人[体重指数(BMI)≥30kg/m2]和正常人(BMI＜25kg/m2)各50例,抽提基因组DNA;用PCR-SSCP技术筛查瘦素受体基因外显子1～7、12和18及内含子2的变异.结果在瘦素受体基因内含子2处发现有碱基改变(T→C);瘦素受体基因外显子18发现碱基改变(C→A),导致其968位氨基酸由丙氨酸→天冬氨酸.结论瘦素受体基因内含子2发生碱基改变可能引起瘦素受体基因RNA剪切异常,导致产生异常的瘦素受体;瘦素受体基因外显子18碱基改变,导致其968位氨基酸由丙氨酸→天冬氨酸,氨基酸改变可能影响受体的空间构象,从而影响其功能.     

甲状腺激素反应蛋白1基因-一个新的鼠脑甲状腺激素反应基因的克隆、表达分布及其功能预测

目的 克隆新的大鼠脑甲状腺激素反应基因，研究其表达特征并初步预测其功能。方法 建立先天性甲状腺功能减退(甲减)新生大鼠模型，用荧光标记的差异显示PCR(DD-PCR)技术、亚克隆、测序及相似性检索获得未知的大鼠脑甲状腺激素反应基因的cDNA片段。采用电子克隆、RT-PCR、测序并克隆其cDNA全长。经Northem印迹法证实其表达受到甲状腺激素的调节，并用半定量RT-PCR方法和生物信息学技术观察其分布转录水平和预测其功能。结果克隆了甲状腺激素反应蛋白1(thyroid hormoneresponse protein-1，TRP-1)基因全长cDNA，共973bp(基因登录号为AF348365)，在甲减新生大鼠的脑中，该基因的转录增强。该基因表达广泛，以脑组织中的表达水平最高；其在大鼠不同脑区的表达含量亦不同，以嗅脑最高。该基因的编码产物具有一些重要的结构域和功能基序。结论 TRP-1基因是新发现的甲状腺激素反应基因，它在正常的脑发育中可能具有重要的作用，其异常表达可能是甲减性脑发育障碍发生的分子机制之一。     

受血糖调控的定点突变胰岛素原真核表达载体的构建

目的 构建受血糖调控的含葡萄糖-6-磷酸酶(G6p)启动子的定点突变胰岛素原基因真核表达载体。方法 应用基因突变技术(重叠延伸拼接法)改变胰岛素原C肽两端的氨基酸序列，使之能被存在于大多数细胞中的furin酶所识别并剪切为成熟的胰岛素，新序列命名为INS／furin；应用基因重组技术将G6p启动子序列替代真核表达载体pIRES中的CMV启动子序列，并将INS／furin亚克隆至pIRES的多克隆位点B。结果SgfI和SacI、XbaI和NotI两种组合的双酶切及特定引物测序均证实载体构建成功。结论 带有G6p启动子的含定点突变胰岛素原基因的真核表达载体有望成为糖尿病基因治疗理想的候选载体。     

IA-2基因的克隆及原核表达研究

目的 应用基因获取足量且具有免疫活性IA－2重组蛋白,为建立IA－2抗体检测方法奠定基础。方法 通过逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）法从小鼠脑组织RNA中扩增编码IA－2胸内结构域的cDNA,构建表达型重组质粒,以DNA序列分析确证后,在大肠杆菌中表达,用亲和层析纯化融合目的蛋白,并以斑点印迹技术（Dot blot)鉴定其免疫原性。结果 所获特异CR产物正确重组至Pimpoint Xa-1表达载体中。经异丙基硫代半乳糖苷诱导的原核表达及亲和层析得到了纯度较高、相对分子质量约56000的融合目的蛋白,表达量约1mg蛋白／升菌液,且表达产物与谷氨酸脱羧酶抗体阳性的糖尿病患者血清及健康对照血清发生的显色反应差异有显著性（P＜0.05)。结论 原核表达的IA－2融合蛋白具有免疫学活性,可用用于糖尿病患者血清中相关抗体的检测。     

差异显示PCR分析高脂饮食诱导的肥胖大鼠脂肪组织的基因表达谱

本实验采用高脂饮食饲养ＳＤ大鼠 ,建立肥胖大鼠模型 ,用差异显示ＰＣＲ(ＤＤ ＰＣＲ)方法比较高脂饲料组大鼠与普通饲料组大鼠脂肪组织中基因表达的差异 ,力求发现受饮食调控的基因 ,探讨高脂饮食致肥胖的分子机制。一、材料和方法1.动物模型与标本采集 :2 0只ＳＤ大鼠分为高脂饲料组和普通饲料组。动物饲养 16周。2 .脂肪组织总ＲＮＡ的抽提及处理 :(1)脂肪组织总ＲＮＡ的抽提 :取 1ｇ大网膜脂肪组织按照Ｔｒｉｚｏｌ总ＲＮＡ抽提试剂盒说明书进行。 (2 )总ＲＮＡ的处理 :用不含ＲＮＡ酶的ＤＮＡ酶处理抽提的总ＲＮＡ以去除含有的少量基因…