骨髓间质干细胞体外预构组织工程化肌腱的实验研究

目的探讨骨髓间质干细胞与胶原-聚羟基乙酸的细胞相容性,为构建组织工程化肌腱寻求理想方法.方法以贴壁法分离、培养骨髓间质干细胞,并检测CD44.在实验组中将骨髓间质干细胞置入含胶原-聚羟基乙酸的DMEM培基中培养:在对照组中将骨髓间质干细胞置入DMEM培基中培养.通过MTT方法比较两组的细胞活性和生长情况,并对实验组进行超微观察.以骨髓间质干细胞为种子细胞,以胶原-聚羟基乙酸为支架在体外预构组织工程化肌腱.结果以贴壁法原代培养骨髓间质干细胞,11天细胞即汇合成片,检测CD44示阳性.骨髓间质干细胞接种于胶原-聚羟基乙酸中混合培养后14天生长良好,始终保持89%以上的细胞活力,与对照组比较无显著差别;实验组细胞数未发生明显改变,而对照组从第4天开始即发生增殖.透射电镜示实验组细胞培养14天后仍保持旺盛的分泌功能.体外预构的组织工程化肌腱具有良好的形态,细胞伸展成梭形,沿聚羟基乙酸缝线大致平行排列.结论骨髓间质干细胞与胶原-聚羟基乙酸的细胞相容性好.以骨髓间质干细胞为种子细胞,以胶原-聚羟基乙酸为支架可在体外初步预构组织工程化肌腱.     

89例下肢瘢痕癌的诊治体会

目的：总结下肢瘢痕癌的临床特点及其诊治方法。方法：回顾性分析中南大学湘雅医院烧伤重建外科 1998年1月至2017年12月收治的89例下肢瘢痕癌患者的临床资料,包括人口统计学、致伤因素、癌变潜伏期、病变部 位、溃疡面积、病理类型、骨质侵犯、淋巴结转移情况、手术方式、修复方法与预后等。结果：89例下肢瘢痕癌患 者中,男70例,女19例;最常见致伤因素依次为火焰烧伤(42例)、创伤(19例)、烫伤(12例)。病变最常见于小腿(31 例),其次为大腿(11例)、足跟(11例);溃疡面积为1.5~600.0 cm2 。其中鳞状细胞癌80例、疣状癌8例、肉瘤1例。术前 发现腹股沟淋巴结肿大78例,行腹股沟淋巴结清扫49例,单纯淋巴结活检、切除29例;9例发现淋巴结转移,8例有 骨质侵犯;24例行截肢术,53例行病灶扩大切除皮片移植术,12例行病灶扩大切除皮瓣修复术。65例得到随访,8例 出现复发,其中截肢者2例,扩大切除者6例,且肿瘤复发与手术方式无关(P>0.05)。结论：下肢瘢痕癌复发转移率较 高,需早期发现、早期诊断,应尽早手术治疗并定期随访;腹股沟淋巴结肿大较常见,需行淋巴结活检、切除或清 扫;局部扩大切除、植皮或皮瓣修复是其主要治疗方法,但癌肿较大、侵犯较深且下肢瘢痕广泛、畸形严重者可考 虑截肢。     

额部皮瓣和上臂皮瓣移植修复鼻缺损

目的:观察额部扩张皮瓣和上臂带蒂皮瓣在鼻缺损修复中的应用效果。方法:选择1990-09/2005-09中南大学湘雅医院整形烧伤整形外科收治的鼻缺损患者24例,均知情同意。采用额部扩张皮瓣修复12例,主要为全鼻缺损和鼻大部分缺损;上臂带蒂皮瓣修复12例,主要为鼻下段鼻翼、鼻小柱缺损,其中一期皮管成形同时转移修复较小范围鼻下段鼻翼、鼻小柱缺损4例。术后定期随访,观察皮瓣成活情况、鼻修复后外形、鼻部皮肤颜色与质地及供区瘢痕情况。结果:鼻缺损患者24例全部进入结果分析,无脱落。随访3个月至两年,其中3-6个月8例,6个月至1年10例,1-2年6例。皮瓣全部成活,修复效果基本满意。额部扩张皮瓣修复者鼻部质地、颜色优于上臂带蒂皮瓣,上臂带蒂皮瓣修复者供区瘢痕较隐蔽。结论:额部扩张皮瓣和上臂带蒂皮瓣对鼻缺损患者的修复效果基本满意。     

琥珀酸对体外培养的人成纤维细胞功能的影响

目的　探讨琥珀酸对人成纤维细胞损伤的机制及其在脆弱类杆菌感染中的作用。方法　分别以 5、10、2 0、30mmol L(pH 5.5 )的琥珀酸刺激体外培养的人成纤维细胞 ,2 4h后检测细胞活力、细胞凋亡率、培养上清中的胶原合成量及caspase 3的活性。以等渗盐水刺激的该细胞作为对照组 ,观察刺激前、后各指标的变化。　结果　随着琥珀酸浓度的增高 ,成纤维细胞增殖速度减慢 ,胶原合成量下降 ,细胞凋亡率及caspase 3活性上升。当琥珀酸浓度为 10 30mmol L时 ,caspase 3的活性为 (0 .5 70 7± 0 .0 345 )(0.5 90 4± 0.0 16 8)U,明显高于对照组 (P <0.0 5);当琥珀酸浓度为 2 0、30mmol L时 ,细胞活力及胶原合成量明显低于对照组 ,凋亡率则较之明显增高 (P <0.0 5)。　结论　琥珀酸能抑制成纤维细胞增殖及胶原合成 ,促进细胞凋亡。创面感染时 ,细菌可通过代谢产生琥珀酸抑制创面愈合 ,使感染持续存在。     

毛细管区带电泳激光诱导荧光测定内毒素

内毒素为脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)由脂质(类脂A)、核心寡聚糖和O-特异性多糖组成,是革兰阴性菌细胞壁外膜的重要成分之一,在细菌感染的发病机制中起重要作用[1,2].为了对LPS的制备流程进行即时监控,我们建立了毛细管区带电泳-激光诱导荧光(CZE–LIF)测定脆弱类杆菌提取液中LPS含量的新方法.本法LPS浓度在0.015～0.200 mg/L(内具有良好的线性关系(r=0.996),平均回收率为96.15%～99.01%,日内及日间变动系数(CV)均<5%,最低检测限为0.005 mg/L.与鲎试剂法、ELISA法或凝胶电运法相比[2-4],本法不受热源干扰,方法简便、快速且定量可靠,能对LPS的制备流程进行即时监控,是目前国内外最新的LPS检测方法.     

脆弱类杆菌脂多糖对正常人外周血单个核细胞分泌白细胞介素的影响

目的　通过研究脆弱类杆菌脂多糖 (LPS)对正常人外周血单个核细胞 (PBMC)分泌白细胞介素 2 (IL 2 )和白细胞介 4素 (IL 4 )的影响 ,探讨脆弱类杆菌感染的机制。　方法　采用脆弱类杆菌临床分离菌和标准菌株 (NCTC9343)提取的LPS ,以不同浓度作用于PBMC ,2 4h后收集培养细胞上清 ,运用ELISA法检测其IL 2和IL 4的含量变化。　结果　脆弱类杆菌LPS对正常人PBMC分泌IL 2有显著抑制作用 ,并呈明显的浓度依赖关系 (r=0 .80 2 4 ,P <0 .0 1)。脆弱类杆菌LPS对正常人PB MC分泌IL 4有显著刺激作用 (P <0 .0 5 ) ,但无浓度依赖关系。脆弱类杆菌临床分离菌与标准菌株LPS对正常人PBMC分泌IL 2和IL 4具有相同效应 ,两组之间无明显差异 (r =0 .10 95 ,P >0 .0 5 )。　结论　脆弱类杆菌LPS对正常人PBMC分泌IL 2有抑制作用 ,而对IL 4的分泌有刺激作用     

兔骨髓间质干细胞修复肌腱缺损效果观察

目的　观察兔骨髓间质干细胞(MSCs)修复肌腱缺损的效果。　方法　分离培养家兔MSCs,检测CD44mRNA进行鉴定。6只家兔分为实验组和对照组,每组3只。在兔跟腱处造成3cm长的缺损,实验组家兔以自体MSCs为种子细胞、以胶原聚羟基乙酸(PGA)为生物支架构建肌腱并移植于跟腱缺损处,对照组家兔仅以PGA生物支架修复跟腱缺损。于术后4、8、12周对移植部位进行大体和组织学观察。　结果　MSCs培养11d时CD44mRNA显示阳性。实验组术后8周肉眼可见移植处形成腱样组织, 12周时组织学观察可见形态一致、顺应力学方向排列于胶原中的腱样细胞,类似正常肌腱组织。对照组所形成的新生组织较实验组细小且与周围组织粘连, 12周时组织学观察见细胞排列紊乱,胶原纤维呈松散网丝状。　结论　应用组织工程技术以自体MSCs修复肌腱缺损具有可行性。     

表皮生长因子对小鼠创面组织过氧化物酶体增殖物激活受体β的调节作用

目的 了解小鼠创面外用冻干鼠表皮生长因于(mEGF)后,过氧化物酶体增殖物激活受体β(PPAR-β)表达量的变化及对创面愈合的影响. 方法 于70只BALB/c小鼠背部脊柱两侧各制作1个1.5 cm×0.5 cm全层皮肤缺损创面,将左侧创面设为实验组、右侧创面作为对照组.实验组创面滴加mEGF溶液(5μg/mL)、对照组创面滴加生理盐水.(1)伤后7、11、16 d各取20只小鼠,评估创面愈合率.(2)伤后1、3、7、11、14、18 d切取创缘组织(每时相点创面数为10个),采用免疫组织化学染色法检测PPAR-β蛋白表达,原位杂交法检测PPAR-β mRNA表达量,结果均用积分吸光度(IA)值表示.对实验数据行t检验. 结果 (1)创面愈合率:伤后7、11、16 d,实验组创面愈合率均明显高于对照组(t值分别为3.03、6.05、11.90,P值均小于0.01).(2)免疫组织化学检测:伤后早期PPAR-β蛋白主要表达于2组剖面内芽组织Fb以及创缘KC胞核中,创面上皮化后主要表达于新生上皮及其下层Fb中,创面修复后表达逐渐减弱.实验组伤后各时相点PPAR-β蛋白表达量明显高于对照组(t值为2.15～7.37,P ＜0.05或P ＜0.01),其中伤后3d达高峰[IA值为(3.46±1.33)×103],此时对照组IA值为(2.35±1.09) ×103.(3)原位杂交:伤后2组创面PPAR-β mRNA表达均开始上调,主要阳性表达部位为创面Fb及创缘KC胞质,持续至创面上皮化基本完成时,表达量开始下降.实验组创面各时相点PPAR-β mRNA表达量均明显高于对照组(t值为2.35～6.64,P＜0.05或P ＜0.01),其中伤后3 d达峰值[IA值为(7.3±2.6)×106],此时对照组IA值为(4.5±3.0)×106. 结论 外用mEGF可上调小鼠创面组织中PPAR-β表达并促进创面愈合.     

严重烫伤合并铜绿假单胞菌脓毒症家兔外周血淋巴细胞蛋白质组学的研究

目的 研究烫伤脓毒症时外周血淋巴细胞蛋白质组的变化特点.方法 24只雄性成年家兔被随机分为对照组、烫伤组、烫伤脓毒症2 h和6 h组,每组6只.采用30%总体表面积(TBSA)Ⅲ度烫伤模型,烫伤后24 h经耳缘静脉注射铜绿假单胞菌悬液(ATCC 27853,浓度6×1012 cfu/L)1 ml/kg制备烫伤脓毒症模型;对照组用37 ℃温水进行假烫伤.烫伤组于伤后24 h、烫伤脓毒症组于注射菌液后2 h和6 h取颈动脉血分离淋巴细胞,裂解细胞,提取总蛋白,用双向凝胶电泳分离蛋白质,考马斯亮蓝染色,扫描、分析图像并筛选差异蛋白质点(判断差异的标准为平均表达量相差超过3倍,由本课题组设定).应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析方法得到肽质量指纹图谱,利用Mascot软件搜索数据库鉴定蛋白质.结果 对照组、烫伤组、烫伤脓毒症2 h和6 h组平均蛋白质点数分别为1 051±21、1 026±30、1 078±36、1 065±31,平均匹配率分别为91%、89%、92%、94%.烫伤脓毒症2 h与6 h组间各蛋白质点表达量无差异;与对照组比较,烫伤组、烫伤脓毒症2 h和6 h组共筛选出19个差异蛋白质点,得到鉴定的有12个,包括11种蛋白质,即Cofilin、肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶胞溶质蛋白A、泛素、核苷二磷酸激酶、谷氨酸脱氢酶、硒结合蛋白Ⅰ、β-肌动蛋白、过氧化物氧化还原素6、膜联蛋白Ⅰ、肌动蛋白-3、细胞视黄酸结合蛋白.结论 严重烫伤并脓毒症时外周血淋巴细胞蛋白质组发生变化,表达改变并经鉴定的11种蛋白质功能涉及蛋白质折叠、装配、运输、降解,以及胞内信号传递、炎症、免疫、能量代谢、细胞增殖、分化、凋亡等,这些蛋白质与烧伤后脓毒症的发生有关.     

严重烫伤合并铜绿假单胞菌脓毒症影响家兔外周血中性粒细胞的蛋白质组学研究

目的 研究严重烫伤合并铜绿假单胞菌脓毒症家兔外周血中性粒细胞蛋白质组变化.方法 实验地点在卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室(湘雅医院内),实验动物为健康雄性成年中国本兔24只,随机分为四组(每组6只):对照组(A组)、严重烫伤组(B组)、严重烫伤并脓毒症2 h组(C组)和严重烫伤并脓毒症6 h组(D组).A组37℃温水假烫,B组烫伤(30%TBSA,Ⅲ度)后24h采颈动脉血分离中性粒细胞,C、D组烫伤(30%TBSA,Ⅲ度)后24 h经耳缘静脉注射对数生长期铜绿假单胞菌悬液(ATCC 27853,浓度6×109 cfu/ml,剂量1 ml/kg),再分别于2、6 h后采颈动脉血分离中性粒细胞.裂解细胞,提取总蛋白.利用双向凝胶电泳分离蛋白质,考马斯亮蓝染色,扫描图像,PDQuest软件分析图像并筛选组间差异蛋白质点(判断差异的标准为平均表达量相差超过3倍,由本课题组成员设定).再从凝胶上切割差异蛋白质点,胰酶消化,应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析,得到肽质量指纹图,利用Mascot软件搜索数据库、鉴定蛋白质.结果 A、B、C、D组平均蛋白质点数分别为(759±20)、(749±27)、(786±29)、(774±26)个,平均匹配率分别为93%、91%、89%、92%.C、D两组间蛋白质点表达量差异无统计学意义,B、C、D组与A组比较,筛选出21个差异蛋白质点,鉴定了其中9个,包括7种蛋白质.结论 家兔严重烫伤并铜绿假单胞菌脓毒症时外周血中性粒细胞蛋白质组发生变化,表达改变的有蛋白质二硫键异构酶、β-肌动蛋白、膜联蛋白Ⅰ、巯基特异性抗氧化蛋白等,功能涉及细胞内酶活性、细胞能动功能及变形性、炎症、代谢、抗氧化能力、细胞凋亡等,这些蛋白质与烧伤后铜绿假单胞菌脓毒症有关.