靶向FAK基因RNAi联合吉西他滨抗非小细胞肺癌的作用

目的探讨通过RNAi下调非小细胞肺癌局部粘着斑激酶(FAK)的活性后对吉西他滨药理的影响。方法靶向FAK的shRNA重组质粒转染并下调细胞FAK蛋白表达,用Western Blot检测转染细胞中FAK的下调;利用MTT检测吉西他滨在不同浓度下对转染细胞增殖的影响;用流式细胞术、PI荧光染色检测吉西他滨作用下转染细胞的凋亡;Caspase与Akt活性分别用Apo-ONETM均质Caspase-3/7检测系统、Western blot检测。结果在吉西他滨不参与的情况下,FAK RNAi不能影响细胞的增殖和凋亡,但FAK RNAi明显增加了吉西他滨对肿瘤细胞的灵敏度,Akt活性的下调与这一现象有关。结论靶向FAK的shRNA重组质粒下调细胞FAK蛋白表达能够增加吉西他滨对非小细胞肺癌的细胞毒性。     

调强放疗时代下的临床Ⅱ期鼻咽癌研究进展

摘 要：鼻咽癌(NPC)的治疗已步入到了调强放射治疗(IMRT)时代,患者的治愈率及其生存质量(QOL)明显得到了提高,并且其不良反应也明显减轻。早期NPC的首选是放射治疗,但临床Ⅱ期NPC能否受益于放化疗综合治疗,目前尚有争议。另外,亚组分析发现,提高T2N1M0期患者的预后是临床Ⅱ期鼻咽癌研究进展中的瓶颈。     

D-半乳糖对大鼠骨髓间充质干细胞拟衰老作用的实验研究

目的 探讨D-半乳糖（D-galactose，D-gal）诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stemcells，MSCs）衰老后的形态学及生物学变化情况。方法取3只2月龄SD大鼠MSCs分离培养至第3代，一部分置于含8g／LD-gal的培养液中继续培养至第6代作为诱导组；另一部分在原培养液中继续培养至第6代作为对照组，并作表型鉴定。采用流式细胞仪检测对照组加入8g／LD-gal后4d内细胞周期的分布变化。两组MSCs培养7d并绘制生长曲线，在光镜和透射电镜下观察其形态和结构变化，β-半乳糖苷酶染色、单细胞凝胶电泳检测DNA损伤方法检测其衰老后的生物学行为变化。结果诱导组MSCs镜下呈典型的衰老细胞形态；对照组MSCs形态均匀，长势良好。流式细胞仪检测表明加入D-gal诱导后90％MSCs停留在G0／G1期，而S期和G2／M期MSCs趋于消失，并随诱导时间延长趋势越明显；对照组MSCs各期比例正常。MSCs生长曲线示诱导组生长速度较对照组明显减慢。诱导组约85％呈β-半乳糖苷酶阳性染色，对照组染色为阴性。单细胞凝胶电泳示诱导组MSCs DNA有拖尾现象，对照组MSCs无DNA损伤。结论 D-gal对SD大鼠MSCs的老化具有诱导作用，初步推断8g／L为最适浓度，为研究MSCs衰老提供了较好的模型。     

体外分离与培养SD乳鼠神经干细胞实验过程中部分方法的改进

目的:探讨体外培养与分离SD乳鼠神经干细胞的方法,以便获得大量的神经干细胞.方法:实验于2003-06/10在四川大学华西医学中心细胞生物学教研室完成.分别取出生3 d的SD乳鼠侧脑室和大脑皮质,用改进后的胰蛋白酶消化法分离单个细胞,进行细胞培养,加20μg/L表皮生长因子,20μg/L碱性成纤维细胞生长因子刺激生长,用半定量法换培养液,用免疫细胞化学方法对神经干细胞进行鉴定,流式细胞仪分别对每天培养的神经干细胞凋亡率进行检测.结果:①所获得的克隆细胞具有抗巢蛋白免疫荧光反应阳性、具有增殖、血清诱导分化的特性,证明这些细胞为神经干细胞.②培养的侧脑室神经干细胞比大脑皮质的神经干细胞增殖快.③改进的胰蛋白酶消化法得到了1×108 L-1单细胞,避免了过度消化或过度机械吹打造成的细胞碎片.④含20μg/L表皮生长因子和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子培养基适合神经干细胞短期培养.⑤流式细胞仪定量检测细胞凋亡率呈下降趋势.结论:SD乳鼠体外培养神经干细胞取材最佳位置应该是脑室管膜或室管膜下.神经干细胞的存活和分裂有赖于表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子按一定比例的共同作用.采用改进的胰酶消化法提高有效细胞产生率,应用半定量换液法可有效减少细胞凋亡率.     

体外分离与培养SD乳鼠神经干细胞实验过程中部分方法的改进

目的：探讨体外培养与分离SD乳鼠神经干细胞的方法，以便获得大量的神经干细胞，方法：实验于2003-06／10在四川大学华西医学中心细胞生物学教研室完成分别取出生3d的SD乳鼠侧脑室和大脑皮质，用改进后的胰蛋白酶消化法分离单个细胞，进行细胞培养，加20μg／L表皮生长因子，20μg／L碱性成纤维细胞生长因子刺激生长，用半定量法换培养液，用免疫细胞化学方法对神经干细胞进行鉴定，流式细胞仪分别对每天培养的神经干细胞凋亡率进行检测。结果：①所获得的克隆细胞具有抗巢蛋白免疫荧光反应阳性、具有增殖、血清诱导分化的特性，证明这些细胞为神经干细胞。②培养的侧脑室神经干细胞比大脑皮质的神经干细胞增殖快。③改进的胰蛋白酶消化法得到了1&;#215;10^8L^-1单细胞，避免了过度消化或过度机械吹打造成的细胞碎片。④含20μg／L表皮生长因子和20μg／L碱性成纤维细胞生长因子培养基适合神经干细胞短期培养。⑤流式细胞仪定量检测细胞凋亡率呈下降趋势。结论：SD乳鼠体外培养神经干细胞取材最佳位置应该是脑室管膜或室管膜下。神经干细胞的存活和分裂有赖于表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子按一定比例的共同作用。采用改进的胰酶消化法提高有效细胞产生率，应用半定量换液法可有效减少细胞凋亡率。     

TIGAR调节肺癌细胞的增殖和侵袭能力研究

目的探讨P53下游基因TIGAR在肺癌细胞A549增殖、迁移及侵袭中的作用。方法采用siRNA技术在A549细胞中干扰TIGAR的表达,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖,小室法检测细胞迁移,肿瘤细胞侵袭实验检测细胞侵袭,免疫印迹杂交检测相关蛋白水平变化。结果在A549细胞中成功干扰TIGAR后,细胞增殖显著降低(P0.05),细胞迁移和侵袭能力显著减弱,侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达量均下调。结论 TIGAR促进肺癌细胞A549的增殖,并促进细胞的迁移和侵袭能力。     

Abraxne 对Lewis 肺癌小鼠Per 2 基因 及SIRT1 因子表达的影响

目的 探讨白蛋白结合型紫杉醇（Abraxne）对Lewis 肺癌模型小鼠生物钟基因Per 2、沉默信息 调节因子1（SIRT1）表达的影响。方法 将60 只SPF 级C57BL/6 雌性小鼠随机分为正常对照组、模型组、 紫素组[ 紫素30 mg/（kg·d）]、Abraxne 组[Abraxne 30 mg/（kg·d）],每组15 只。除正常对照组外,其他 各组小鼠于右腋部背侧皮下接种Lewis 肺癌细胞（LLC）复制Lewis 肺癌小鼠模型。于接种后第5 天开始尾 静脉注射给药,连续用药10 d,观察各组小鼠体重、肿瘤体积及生物学行为变化。采用实时荧光定量聚合酶 链反应和Western blot 检测肿瘤组织中Per2、SIRT1 mRNA 和蛋白的表达。结果 4 组小鼠接种LLC 细胞 前、接种后第5 天、给药后第5 和10 天的体重变化比较,结果显示：①不同时间点的体重有差别（F =17.703, P =0.000）;② 4 组小鼠体重有差别（F =7.976,P =0.000）;③ 4 组小鼠体重变化趋势有差别（F =21.641, P =0.000）。模型组、紫素组、Abraxne 组小鼠给予Abraxne 治疗后第0、2、4、6、8 和10 天的肿瘤体积比较, 结果显示：①不同时间点的肿瘤体积有差别（F =35.128,P =0.000）;② 3 组小鼠肿瘤体积有差别（F =8.376, P =0.000）;③ 3 组小鼠肿瘤体积变化趋势有差别（F =43.624,P =0.000）。与模型组比较,紫素组和Abraxne 组小鼠肿瘤组织中Per2、SIRT1 mRNA 和蛋白表达水平升高（P <0.05）,且Abraxne 组小鼠肿瘤组织中Per2、 SIRT1 mRNA 和蛋白表达水平高于紫素组（P <0.05）。结论 Abraxne 较紫素更能抑制Lewis 肺癌小鼠肿瘤 生长,其机制可能与生物钟基因Per 2、SIRT 1 的表达被强化有关。     

SLC基因重组腺病毒的构建

目的 构建携带次级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoid organ chemokine, SLC)基因的重组腺病毒.方法 采用PCR技术从含有SLC基因的质粒上扩增出SLC基因,将PCR产物酶切后连接至pENTR11载体上,再通过pENTR11与腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST之间的同源重组作用将SLC基因片段重组至pAd/CMV/V5-DEST上,最后经293细胞的包装扩增后得到携带SLC基因的重组腺病毒.结果 成功将SLC基因片段克隆至pAd/CMV/V5- DEST载体上,并经293细胞包装出病毒颗粒;经测定病毒滴度为2.6×108 pfu/mL.结论 构建的重组SLC腺病毒可将SLC基因导入肿瘤细胞或组织内,为进一步研究SLC基因的抗肿瘤作用提供了基础.     

化疗期间不同时间段肿瘤患者CIK细胞抗肿瘤作用的体外研究

目的:研究同一肿瘤患者在化疗期间不同时间段自体CIK细胞对不同癌细胞株杀伤活性的差异.方法:分离化疗期间不同时间段肿瘤患者外周血单个核细胞(PBMC),加入细胞因子,体外诱导CIK细胞,用MTT法检测其对不同时间段不同癌细胞株的杀伤活性及随化疗次数变化的趋势,杀伤活性比较采用方差分析.结果:化疗期间不同时间段CIK细胞对肺癌(A549)、肠癌(HCT-116)、鼻咽癌细胞珠(CNE2)的杀伤活性比较:同一肿瘤患者的CIK细胞随着化疗次数的递增,对肺癌细胞株、肠癌细胞株的杀伤活性逐渐降低,不同时段差异具有统计学意义(P＜ 0.001),鼻咽癌细胞株杀伤活性无规律性变化(P＞0.05);同一化疗时间段,CIK细胞对不同癌细胞株杀伤活性的比较:对肺癌细胞株的杀伤活性最强,对鼻咽癌细胞株的杀伤活性最差.结论:化疗联合自体CIK细胞在化疗不同时间段对不同癌细胞株的杀伤活性有差异.