JMJD6参与调节肿瘤抑制因子p53的转录活性

目的确定JMJD6与转录因子p53的相互作用,研究JMJD6对p53转录活性的影响,并通过鉴定JMJD6的赖氨酸羟化酶活性探讨其可能的作用机制。方法免疫共沉淀技术和GST pull-down实验分析JMJD6和p53的相互作用及其作用区域;荧光素酶双报告基因系统检测JMJD6对p53靶基因启动子活性的影响;体外羟基化实验和质谱鉴定JMJD6的羟化酶活性。结果 JMJD6与p53相互作用,并由p53的C端结构域介导;JMJD6参与激活p53的转录活性;JMJD6具有赖氨酸羟化酶活性,可以催化组蛋白H4发生羟基化。结论赖氨酸羟化酶JMJD6可以结合肿瘤抑制因子p53并参与调节其转录活性。     

HSD1与微管蛋白在生精细胞中的定位关系研究

目的 确定HSD1与微管蛋白在生精细胞中的定位关系,为进一步研究其在精子发生中的功能奠定基础.方法 通过分子克隆方法构建GFP-HSD1和FLAG-HSD1的真核表达质粒,转染精母细胞系GC-2spd (ts),同时筛选稳定表达FLAG-HSD1的细胞株.应用免疫荧光实验观察外源和内源表达的HSD1与微管蛋白α-tubulin在GC-2spd(ts)或小鼠原代生精细胞中的定位分布.结果 成功构建稳定表达FLAG-HSD1融合蛋白的GC-2spd(ts)细胞株.外源表达HSD1在GC-2 spd(ts)中与α-tubulin明显共定位;内源表达HSD1与α-tubulin在GC-2spd(is)和原代小鼠生精细胞中明显共定位.结论 HSD1与微管蛋白α-tubulin在生精细胞中存在明显的共定位关系.     

染色质体外组装相关蛋白的表达纯化及组装体系的建立

目的提取并纯化真核细胞核内组蛋白,表达并纯化重组组蛋白、染色质组装相关因子NAP-1(nuclear assemblyprotein-1)及ACF(ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor),并建立无细胞体外染色质组装体系。方法在大肠杆菌BL21中表达并应用离子交换层析纯化组蛋白,从真核细胞HeLa细胞核中提取并应用羟基磷灰石纯化组蛋白八聚体,利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞Sf9中表达并纯化组装相关因子,应用纯化得到的蛋白在适宜条件下进行染色质体外组装,并用微球菌核酸酶酶切检测。结果获得了高纯度的原核表达的组蛋白,真核细胞组蛋白八聚体及组蛋白特异伴侣NAP-1和ACF;建立了由质粒DNA、纯化的真核细胞核内重组组蛋白、重组NAP-1、重组ACF及ATP为核心成分的体外染色质组装的无细胞系统,经微球菌核酸酶检测组装成功。结论利用体外分离纯化的多种重组蛋白,可成功构建基因的染色质模板,为在体外染色质模板上进行基因转录的调控机制研究奠定了基础。     

HRSP12慢病毒表达载体的构建及对宫颈癌HeLa细胞凋亡及增殖的影响

目的 构建热反应蛋白12（heat-responsive protein 12,HRSP12）慢病毒表达载体pWPI-HRSP12,包装慢病毒颗粒并感染宫颈癌细胞HeLa,分析过表达的HRSP12对HeLa细胞凋亡和增殖的影响.方法 用反转录PCR扩增HRSP12全长编码顺序,构建慢病毒表达载体,利用人胚肾细胞HEK293T包装重组的慢病毒颗粒,感染HeLa细胞,用蛋白免疫印迹法检测剪切的半胱氨酸/天冬氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）并用MTS比色法检测HeLa细胞增殖的情况.结果 编码全长HRSP12的cDNA片段为414bp,克隆至pWPI-linker载体成功构建了慢病毒表达载体pWPI-HRSP12,包装的慢病毒颗粒能够高效感染HeLa细胞,在细胞内表达Flag-HRSP12融合蛋白.HRSP12的过表达能够引起HeLa细胞caspase-3的剪切体增多,能够抑制HeLa细胞的增殖.结论 成功构建了慢病毒表达载体pWPI-HRSP12,初步结果表明,HRSP12可能具有诱导HeLa细胞凋亡、抑制细胞增殖的活性,为进一步研究HRSP12的生物学功能奠定了基础.     

IFN-λR1与TRAF6的相互作用及对NF-κB与ISRE活性的影响

目的 构建含有信号肽的全长IFN-λR1质粒,研究在配体IFN-λ1存在的情况下IFN-λR1与TRAF6的相互作用及对NF-κB与ISRE活性的影响.方法 利用多次PCR将信号肽编码序列引入IFN-λR1序列中,构建表达载体,用免疫荧光及膜蛋白分离实验鉴定IFN-λR1的表达定位.用免疫共沉淀的方法研究IFN-λ1刺激下IFN-λR1与TRAF6间的相互作用.用双荧光素酶报告基因实验研究IFN-λR1与TRAF6相互作用后对下游NF-κB与ISRE活性的影响,采用实时定量PCR的方法检测此种作用对OAS1与Mx1基因表达的影响.结果 成功构建了含信号肽的全长IFN-λR1表达载体,细胞内表达的IFN-λR1可正确定位于细胞膜上.细胞共转染IFN-λR1和TRAF6,在免疫沉淀物中可以检测到两个蛋白同时存在.细胞内共表达的IFN-λR1能够抑制TRAF6诱导的NF-λB的激活,而共表达的TRAF6可以抑制IFN-λR1下游ISRE的活性,并下调OAS1与Mx1基因的表达.结论 证实了在IFN-λ1存在下IFN-λR1与TRAF6的相互作用及二者相互作用对各自细胞信号转导通路的影响,为TRAF6作为IFN-λ受体信号通路中的相互作用蛋白提供了新的实验依据.     

MCF10A-Er-Src诱导转化模型的构建

目的 构建能够被他莫西芬（tamoxifen,TAM）激活的MCF10A-Er-Src诱导转化模型.方法 利用PCR扩增法分别获得雌激素受体配体结合结构域序列（hbER）和Src序列,并将其分别插入到改造后的反转录病毒表达载体pMSCV-FLAG-HA中,构建ER-Src融合蛋白表达质粒.包装pMSCV-ER-Src-FLAG-HA重组反转录病毒,感染MCF10A,利用基因组PCR和Western blot法筛选能够稳定表达外源融合蛋白ER-Src的细胞系.利用免疫沉淀（IP）和Western blot法验证TAM对稳转细胞系的激活,并观察细胞形态变化.结果 构建的MCF10A-Er-Src细胞系能够稳定表达ER-Src融合蛋白.TAM能诱使Src第416位酪氨酸发生磷酸化,从而激活Src,使MCF10A-Er-Src发生转化.结论 成功获得能够被TAM诱导激活的MCF10A-Er-Src转化模型.