睾丸高表达蛋白质HSD-14对小鼠精子发生的影响

目的 研究睾丸高表达基因HSD-14及其编码蛋白质对小鼠精子发生的影响.方法 利用本实验室构建的人睾丸特异ESTs文库,通过电子克隆方法获得一新基因命名为HSD-14基因.纯化原核表达的HSD-14蛋白,并制备兔多克隆抗体.通过HE染色观察腹腔注射HSD-14纯化蛋白或睾丸曲细精管显微注射HSD-14纯化抗体后小鼠睾丸组织的生精变化,并进行TUNEL凋亡检测.结果 电子克隆获得HSD-14基因,在原核表达系统中表达成功.小鼠腹腔注射HSD-14纯化蛋白或睾丸曲细精管显微注射HSD-14纯化抗体后,均发现曲细精管中生精细胞大量脱落,生精细胞的层次紊乱,管腔内有时可见成团脱落的生精细胞,附睾中几乎观察不到成熟精子.TUNEL凋亡检测结果表明,抗体注射组小鼠曲细精管中生精细胞(以精母细胞为主)凋亡程度较正常小鼠睾丸和免疫前血清注射组明显,且多数细胞停留在精母细胞甚至精原细胞的阶段.结论 HSD-14通过诱导精母细胞凋亡抑制小鼠精子发生.     

特洛伊肽运载核酸的研究进展

特洛伊肽(trojan peptides),又称细胞穿透肽(cell-penetrating peptides,CPP)或蛋白转导域(protein transduction domains,PTD),是一类少于30个氨基酸的小肽片段,它们一般含有多个碱性氨基酸,能够高效跨越细胞膜并将多种不同类型的大分子物质(如多肽,蛋白质,核酸等)运送至细胞内.本综述主要阐述了利用特洛伊肽将质粒DNA和siRNA运送至培养的哺乳动物细胞以及动物体内的研究进展,并阐明了这一运载系统在基因功能研究和临床应用上的巨大潜力和意义.     

新疆哈萨克族人弗林蛋白Furin基因变异与高总胆固醇血症、高低密度脂蛋白胆固醇血症的相关性

目的 研究新疆哈萨克族人高总胆固醇血症、高低密度脂蛋白胆固醇血症与弗林蛋白(Furin)基因变异的相关性。方法 本研究是以横断面流行病学调查为基础的病例-对照研究,878例研究对象均来自新疆哈萨克族自然人群。测定48例随机选择的哈萨克族高胆固醇血症患者(女性24例、男性24例)弗林蛋白基因启动子、外显子区序列,筛查代表性变异。采用TaqMan PCR分析弗林蛋白基因变异在878例哈萨克族自然人群(男性370例、女性508例)中的分型,分析其与哈萨克族人血总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平的相关性。结果 在48例高胆固醇血症患者中,共筛查出弗林蛋白基因的12个变异,包括4个代表性变异(rs6226、rs6227、rs2071410、rs4932178)。4个代表性变异均在大样本哈萨克族人中基因型分型成功(成功率≥99%)。在哈萨克族自然人群中,rs6226、rs6227、rs2071410、rs4932178多态性的基因型、等位基因、单体型频率分别在高胆固醇血症组、对照组间及高低密度脂蛋白胆固醇血症组、对照组间的分布差异均无统计学意义(P均＞0.05);每个多态性的不同基因型携带者之间的血总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇平均水平差异无统计学意义(P均＞0.05)。结论 新疆哈萨克族人高总胆固醇血症、高低密度脂蛋白胆固醇血症与弗林蛋白基因变异不相关,该变异可能不是哈萨克族人高胆固醇血症、高低密度脂蛋白胆固醇血症的易感因素。     

JMJD6参与调节肿瘤抑制因子p53的转录活性

目的确定JMJD6与转录因子p53的相互作用,研究JMJD6对p53转录活性的影响,并通过鉴定JMJD6的赖氨酸羟化酶活性探讨其可能的作用机制。方法免疫共沉淀技术和GST pull-down实验分析JMJD6和p53的相互作用及其作用区域;荧光素酶双报告基因系统检测JMJD6对p53靶基因启动子活性的影响;体外羟基化实验和质谱鉴定JMJD6的羟化酶活性。结果 JMJD6与p53相互作用,并由p53的C端结构域介导;JMJD6参与激活p53的转录活性;JMJD6具有赖氨酸羟化酶活性,可以催化组蛋白H4发生羟基化。结论赖氨酸羟化酶JMJD6可以结合肿瘤抑制因子p53并参与调节其转录活性。     

全外显子组测序技术检出Kallmann syndrome患者KAL1基因新突变

目的 分析Kallmann syndrome家系患者的分子遗传机制.方法 利用全外显子组测序技术对先证者进行测序分析,按照ACMG解读规则筛选致病性突变,Sanger测序对所有家系成员验证突变结果.结果 捕获且比对到目标区的碱基量为3418.98Mb,平均测序深度为77.66X,覆盖度为99.23％,共检出5056个变异,3174为罕见变异（RSV）,KAL1基因c.1735_1736insT突变为疑似致病性突变,且满足家系共分离.结论 KAL1基因c.1735 1736insT框移突变为新的疑似致病性突变.     

KLF4的结构、功能及其与癌症的关系

Krüppel样因子（Krüppel-like factor,KLF）是人类组织中广泛表达的锌指型转录因子,由Shields等[1]于1996年在小鼠中发现,因其与黑腹果蝇的分节蛋白Krüppel的DNA结合序列具有同源性故而得名.KLF蛋白在许多不同的生理活动包括细胞增殖、生长、分化和正常组织稳态的维持中具有重要作用.其中KLF4在不同的肿瘤组织中可以通过与不同的靶基因作用,发挥癌基因或者抑癌基因两种完全相反的功能,在结肠癌、胃癌、皮肤癌、膀胱癌、肝癌中均发现KLF4表达降低,而在原发性乳腺导管癌、口腔鳞癌中KLF4表达升高[2-4].虽然在不同肿瘤中研究KLF4功能的结果不同,但都指出KLF4在肿瘤的发生与发展中具有重要作用.     

睾丸表达新基因HSD-28的克隆及其编码蛋白质的研究

目的 研究从人初级精母细胞特异EST文库中克降的新基因HSD-28及编码蛋白质在精子发生过程中的表达及可能发挥的功能.方法 利用根据本实验室构建的人初级精母细胞特异EST文库,通过电子克隆方法,从网络数据库资源获取基因HSD-28.纯化原核表达系统表达的HSD-28蛋白,以此免疫新西兰白兔制备针对HSD-28的特异性多克隆抗体.采用免疫组化的方法研究HSD-28在人睾丸组织中的表达定位.最后,利用酵母舣杂交系统筛选与HSD-28相互作用的蛋白质.结果 克隆得到了的HSD-28基因,提交GenBank获得登陆号为AY251533,全长为641个碱基,其中开放阅读框为504碱基,编码一个由168个氨基酸构成的蛋白质,命名为HSD-28蛋白.将构建的pET-30a-HSD-28重组质粒转化到BL21(DE3)宿主菌,表达并纯化了HSD-28蛋白,大小约为28kDa.免疫组织化学结果显示,HSD-28蛋白特异的定位于人精原细胞和早期初级精母细胞.筛选得到与HSD-28相互作用的两个阳性克隆45#和106#.结论 从人睾丸cDNA文库中成功克隆得到HSD-28基因,其编码蛋白质表达定位于人精原细胞和初级精母细胞中,可能参与精子发生过程中减数分裂的调节.     

CRIF1参与高糖诱导的rRNA基因转录

目的 探索CRIF1在高糖诱导下对rRNA基因转录中的作用。方法 在HEK293T细胞中,转染CRIF1表达载体或空载对照,培养48h后收取细胞提取总RNA,通过RT-qPCR检测pre-rRNA的mRNA水平;用含0、1、4.5g/L糖浓度的培养基培养HEK293T细胞12h后,收集全细胞提取物,进行Western blot法检测CRIF1蛋白的表达水平;在HEK293T细胞中转染shCRIF1干扰质粒或空载对照,36h后换用含0、1、4.5g/L糖浓度的培养基继续培养细胞12h后,收取细胞提取总RNA,通过RT-qPCR检测pre-rRNA的水平。结果 CRIF1可促进pre-rRNA的表达;随着糖浓度的升高,CRIF1的表达量逐渐增加;敲低CRIF1可抑制糖浓度依赖的pre-rRNA的表达。结论 CRIF1可提高高糖诱导下pre-rRNA的表达水平,从而参与高糖诱导的rRNA基因的转录调控。     

一个X连锁显性遗传Nance-Horan综合征家系致病突变的遗传学研究

目的对中国东北辽宁地区一个三代后极性先天性白内障合并小眼球小角膜家系进行致病变异筛查,为临床明确诊断及遗传咨询提供必要的遗传学依据。 方法2017年4月采集该家系中2例患者和1例正常对照者的外周静脉血,提取基因组脱氧核糖核酸,对先证者进行眼部检查。通过MiSeq测序平台对4813个临床疾病相关基因进行高通量测序,寻找致病变异位点。 结果该家系表现为后极性先天性白内障伴有小眼球小角膜,呈X连锁显性遗传。对家系中3个成员基因组脱氧核糖核酸进行测序,发现家系内患者携带X染色体NHS基因无义突变(NHS c．742C>T,p.R248^*),该突变在家系中与疾病表型共分离。通过查询人类基因突变数据库,该突变为Nance-Horan综合征致病突变,患者临床表现与该综合征相符。 结论该家系诊断为Nance-Horan综合征,NHS基因c.742C>T(p.R248^*)突变是该家系的致病变异。     

HRSP12慢病毒表达载体的构建及对宫颈癌HeLa细胞凋亡及增殖的影响

目的 构建热反应蛋白12（heat-responsive protein 12,HRSP12）慢病毒表达载体pWPI-HRSP12,包装慢病毒颗粒并感染宫颈癌细胞HeLa,分析过表达的HRSP12对HeLa细胞凋亡和增殖的影响.方法 用反转录PCR扩增HRSP12全长编码顺序,构建慢病毒表达载体,利用人胚肾细胞HEK293T包装重组的慢病毒颗粒,感染HeLa细胞,用蛋白免疫印迹法检测剪切的半胱氨酸/天冬氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）并用MTS比色法检测HeLa细胞增殖的情况.结果 编码全长HRSP12的cDNA片段为414bp,克隆至pWPI-linker载体成功构建了慢病毒表达载体pWPI-HRSP12,包装的慢病毒颗粒能够高效感染HeLa细胞,在细胞内表达Flag-HRSP12融合蛋白.HRSP12的过表达能够引起HeLa细胞caspase-3的剪切体增多,能够抑制HeLa细胞的增殖.结论 成功构建了慢病毒表达载体pWPI-HRSP12,初步结果表明,HRSP12可能具有诱导HeLa细胞凋亡、抑制细胞增殖的活性,为进一步研究HRSP12的生物学功能奠定了基础.