TLR2-MyD88通路在B细胞交叉提呈肿瘤来源自噬小体抗原过程中作用的初步研究

为研究B细胞表面TLR2在B细胞交叉提呈肿瘤来源自噬小体(tumor derived-autophagosome,DR)抗原诱导效应T细胞再活化过程中的作用,DR经淋巴结注射方式免疫C57BL/6小鼠,收获免疫小鼠的淋巴结细胞作为效应T细胞;以负载DR的C57BL/6、TLR2~(-/-)和MyD88~(-/-)及TLR2抗体封闭的小鼠脾脏B细胞作为pAPC。DR分别与分离纯化的WT C57BL/6、TLR2~(-/-)和MyD88~(-/-)及TLR2抗体封闭后的小鼠B细胞共孵育,然后与免疫小鼠CD4~+T和CD8~+T细胞共孵育,流式细胞术及ELISA法检测IFN-γ的分泌水平。结果显示,与WT C57BL/6小鼠B细胞组相比,负载DR的TLR2~(-/-)B细胞和MyD88~(-/-)B细胞及TLR2抗体封闭的B细胞活化效应CD8~+T和CD4~+T细胞产生的IFN-γ水平显著降低。以上结果提示B细胞交叉提呈DR抗原、诱导效应T细胞活化依赖于TLR2/MyD88信号通路。     

高压氧对Aβ25-35诱导大鼠认知和记忆障碍及其海马神经元凋亡的影响

目的探讨高压氧(HBO)治疗对β-淀粉样蛋白（Aβ）25-35所致拟阿尔茨海默病（AD）模型大鼠认知和记忆功能的改变及其海马神经元凋亡情况的影响。 方法选取健康成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠48只,按随机数字表法分为正常对照组、假手术组、模型组和HBO治疗组,每组12只。正常对照组不做任何处理。其余各组大鼠给予10％水合氯醛(4ml)腹腔注射麻醉,假手术组大鼠每侧海马注射5μl生理盐水;造模大鼠（模型组和HBO治疗组）每侧海马注射5μl的Aβ25-35制备拟AD大鼠痴呆模型。造模成功后,模型组大鼠不做任何治疗处理;HBO治疗组大鼠造模2周后,常规HBO治疗,每日1次,10d为1个疗程,中间休息3d,共2个疗程。采用Morris水迷宫法观察各组大鼠空间记忆能力的改变,TUNEL染色观察大鼠海马神经元凋亡情况的改变,同时检测海马组织凋亡相关基因Bcl-2和Bax的mRNA、蛋白表达的改变。 结果水迷宫实验中,第5天和第6天HBO治疗组大鼠的逃避潜伏期与模型组比较显著缩短［（33.4±4.5）s比（48.1±2.7）s,（20.8±1.7）s比（40.5±1.9）s,P<0.05］,空间探索实验中HBO治疗组大鼠在原平台所在象限的时间及穿过原平台的次数较模型组显著增加［（35.8±5.6）%比（21.1±3.8）%,（4.8±1.1）次比（3.1±1.2）次,P<0.05］。TUNEL染色中,模型组海马神经元中胞核呈现棕色凋亡形态的较多,而HBO治疗组则见少数凋亡的海马神经元。海马组织凋亡基因检测中,HBO治疗组Bcl-2 mRNA和蛋白的表达显著高于模型组（P<0.05）,其Bax mRNA和蛋白的表达则相应地降低。 结论HBO可能通过抑制Aβ25-35诱导的海马神经元凋亡而改善AD大鼠模型的认知和记忆能力。     

大鼠肾小球内皮细胞分离培养和鉴定

1.材料和试剂：（1）材料：SD大鼠1-2月龄,体重50-100g,雌雄各半,由东南大学医学院实验动物中心提供。Mini MACS免疫磁珠细胞分选仪、磁性分离柱LS购自Miltenyi Biotec公司。（2）试剂：Ⅳ型胶原酶、内皮细胞生长因子、胰蛋白酶及转铁蛋白均购自Sigma公司,DMEM培养基购自Gibco公司,异硫氰酸荧光素标记的抗CD34-FITC、抗波形蛋白及抗角蛋白均购自Santa Cruz公司,抗FITC免疫磁珠购自Miltenyi Biotec公司。     

正电荷载基因纳米微泡的超声成像及靶向杀伤肝癌细胞的研究

目的：制备载基因纳米微泡并探讨其体内外超声成像和靶向杀伤肝癌细胞的效果。方法：采用薄膜水化?机械震荡法制备磷脂为壳膜、六氟化硫（suphurhexafluoride,SF6）气体为核心的正电荷纳米微泡,再偶联甲胎蛋白（alpha fetoprotein,AFP）启动子的单纯疱疹病毒胸苷激酶（simplex herpes virus thymidine kinase,HSV?TK）质粒DNA制备载基因纳泡。对其形态、平均粒径、zeta电位、DNA结合力、基因转染进行检测;然后对其体内外超声成像特性进行考察;最后采用CCK?8和流式细胞（FCM）分析检测载基因纳泡联合超声靶向微泡击破（ultrasound?targeted microbubble destruction,UTMD）技术对BEL?7402和SMCC?7721细胞的杀伤作用。结果：电镜显示纳泡呈圆球形壳核结构;平均水合粒径约为667 nm,带正电;琼脂糖凝胶电泳显示质量比≥5时,纳泡可有效结合质粒DNA;体内外超声显示载基因纳泡具有良好的超声对比增强特性;RT?PCR检测显示纳泡联合UTMD能使HSV?TK在AFP阳性肝癌细胞内表达。CCK?8 和FCM分析显示载基因纳泡+UTMD组能显著抑制BEL?7402细胞的增殖和诱导其凋亡,与其他组相比差异具有显著性（P < 0.05）。结论：具有良好超声成像功能的载基因纳泡能够高效靶向杀伤AFP阳性的肝癌细胞。     

HCV核心基因插入突变体编码蛋白对人肝癌细胞系(Huh-7)细胞基因表达的影响

目的用基因表达分析法鉴定丙型肝炎病毒(HCV)核心(Core，C)区基因插入突变体编码蛋白在人肝癌细胞系(Huh-7)表达，探讨该蛋白生物学功能及其基因表达改变与致病的关系。方法构建HCV-1bc基因插入突变体编码蛋白重组表达质粒，建立表达c基因插入突变体编码蛋白Huh-7细胞系，按Affymetrix公司实验程序制备探针、再与该公司H0u133A和Hg-u133b芯片杂交。对基因表达上调或下调≥3倍的基因，用NetAflk作进一步分析。并用半定量RT-PCR对其中3个上调基因进行鉴定。结果Microarray分析显示，HCV-1b C基因插入突变体编码蛋白比c蛋白引起更多的基因表达改变，主要集中在信号传导、蛋白酶活性、分子转运、免疫反应等，特别是免疫反应基因表达更加显著。C基因插入突变体编码蛋白表达可同时导致凋亡基因／抗凋亡基因表达上调或下调及致癌基因上调。半定量RT-PCR对有趣的致癌基因FHL2、抗凋亡基因PRKCZ和凋亡基因LGALSI的鉴定结果表明，FHL2、PRKCZ和LGALSI基因的表达比空载体转染对照组相同基因明显上调。结论Hcvc基因插入突变体编码蛋白在Huh-7细胞表达对其基因表达有很大影响，其中对免疫反应基因的影响更明显，这一结果对理解HCV C基因插入突变体编码蛋白在HCV致病过程中的作用及其研制抗HCV药物均有重大的参考价值。     

纳米锰锌铁氧体的生物相容性研究

目的：研究用于肿瘤磁流体热疗的自制纳米级Mn-Zn铁氧体(Mn0.5Zn0.5Fe2O4)的生物相容性。方法：溴化—3(4，5—二甲基噻唑基—2)—2，5—二苯基四唑(MTT)实验评价其体外细胞毒性；溶血试验评价其有无溶血作用：小鼠腹腔注射其无菌生理盐水混悬液以测定其LD50及最大耐受量(MTD)；微核试验评价其有无致畸、致突变作用等。结果：MTT显示该材料对L-929细胞毒性为0～1级；无溶血作用；昆明小鼠腹腔注射该材料混悬液1ml．在极限浓度时的LD50测不出，MTD值达到6g／ks；微核实验结果表明无致畸致突变作用。结论：该材料是一种具有良好生物相容性的材料，应用于肿瘤热疗具有广阔前景。     

三氧化二砷纳米微粒对抑制兔血管平滑肌细胞增殖作用的实验研究

目的 了解纳米微粒与普通剂型的三氧化二砷（As2O3）对抑制体外培养的兔血管平滑肌细胞（VSMC）增殖作用的差别。方法 对照组为不加药物的细胞，实验组为3μmol／L纳米微粒和普通剂型的As2O3，干预体外培养的兔VSMC细胞72h，进行四唑氮盐（MTT）染色测定细胞吸光度（A）值。用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，提取细胞DNA，进行凝胶电泳分析，将3组的结果进行比较。结果 3μmol／L纳米剂型的As2O3，干预细胞，细胞数量随作用时间的延长逐渐减少，细胞生长明显受抑制，而普通剂型干预细胞，生长受抑制程度较纳米剂型弱。24h时，对照组、3μmol／L普通剂型组与纳米组，A值分别为0．68±0．10、0．58±0．12、0．33±0．12，48h时分别为0．79±0．11、0．48±0．14、0．28±0．11，72h时分别为0．96±0．13、0．34±0．15、0．20士0．06，差异均有统计学意义（Ⅳ值分别为10．934、15．039、15．539，P值均〈0．01）。流式细胞仪检测，纳米剂型As2O3、普通剂型As2O3干预及对照组的细胞干预48h，细胞增殖率分别为44．97％、58．54％、74．02％，早期凋亡率分别为16．89％、11．27％、11．20％，晚期凋亡率分别为26．56％、23．60％、12．46％，坏死细胞分别为11．58％、6．59％、2．32％。DNA电泳，As2O3干预细胞，可见凋亡梯形条带，部分细胞坏死，呈模糊的无间隔片状条带。纳米剂型药物作用的细胞DNA条带，梯形条带更多、更模糊。结论 As2O3，可以抑制体外培养的VSMC增殖，且纳米剂型As2O3较普通剂型的As2O3，对细胞抑制作用更强。     

消化道恶性肿瘤患者外周血人类斯钙素1基因表达的检测

一、材料与方法 1.材料：69例消化道恶性肿瘤患者均为东南大学附属中大医院普外科和胸心外科2002年9月-2003年7月住院病人，所有病例均经病理确诊。取术前外周血。以消化道恶性肿瘤组织标本为阳性对照，以非肿瘤患者（14例消化道炎症疾病人群）及健康捐献者（15例健康人群和5例妊娠期妇女）外周血为阴性对照。Trizon试剂为加拿大Sangon公司产品；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒及Taq酶等为日本TAKARA公司产品。     

HPV的致瘤机制与泛蛋白-蛋白酶体系统

人类乳头瘤病毒(HPV)与宫颈癌及其他人类恶性肿瘤的发生有关.这些致瘤性HPV的致瘤潜力依赖于早期基因E6和E7的产物,它们通过泛蛋白-蛋白酶体系统分别降解肿瘤抑制基因蛋白p53、pRb和其他PDZ结构域蛋白,从而达到致瘤的目的.     

茶多酚对高糖时内皮细胞产生活性氧和TGF-β1的影响

目的探讨高糖对内皮细胞产生活性氧和转化生长因子岛(TGF-β1)的影响,以及茶多酚的干预作用。方法培养人脐静脉血管内皮细胞(ECV304),分为正常对照组、高糖组、茶多酚组和茶多酚干预组。培养0、12、36h后,用分光光度比色法测定细胞上清液超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,用RT-PCR法测定细胞内TGF-β1 mRNA的变化。结果高糖导致内皮细胞SOD活性下降和MDA含量升高,上调TGF-β1 mRNA表达,其变化随时间延长更为明显。茶多酚干预可拮抗高糖时内皮细胞的上述改变。结论茶多酚有抑制高糖对内皮细胞的损伤作用。