辐射诱导性自杀基因在胰腺癌细胞中的表达

目的 利用辐射敏感的早期生长反应基因1(Egr-1)启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK),观察其在胰腺癌细胞中的表达效果.方法 以细菌内同源重组法构建含绿色荧光蛋白(GFP)做标志基因的TK基因的腺病毒载体pAdEgr-1-TK,转染人胰腺癌细胞系PC-3 60Co-γ射线照射后,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量分析各不同照射剂量组TK基因的mRNA表达.Western印迹法分析60Co-γ射线照射后转染pAdEgr-1-TK细胞中TK蛋白质的表达量.结果 重组腺病毒载体pAdEgr-1-TK转染胰腺癌细胞系PC-3,不同剂量60Co-γ射线照射后,经RT-PCR半定量分析,TK mRNA表达结果分别为0 Gy(67.3±2.1)%、5 Gy为(89.3±1.0)%、7.5 Gy为(114.7±5.7)%、10 Gy为(140.5±3.1)%、15 Gy为(134.5±4.0)%、20 Gy为(117.4±3.4)%,各照射组TKmRNA表达均明显高于对照组0 Gy(均P<0.01),尤以剂量为10.0 Gy时最为显著.Western印迹分析结果分别为0 Gy为(5.4±0.7)%,5 Gy为(7.6±0.9)%,7.5 Gy为(21.5±1.5)%,10 Gy为(35.7±1.4)%,15 Gy为(32.1±1.2)%,20 Gy为(28.8±1.5)%,60Co-γ射线照射可明显提高转染pAdEgr-1-TK细胞中TK的蛋白质表达量,且蛋白质表达量与辐射剂量呈正相关性.结论 放射敏感性启动子Egr-1基因可驱动TK自杀基因在胰腺癌细胞中高效表达.     

人NRAGE基因重组腺病毒载体的构建及其对293细胞细胞周期的影响

目的构建hNRAGE基因的重组腺病毒载体,并研究其对293细胞细胞周期的影响。方法采用PCR方法扩增hNRAGE基因片段,并亚克隆至腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdTrack-CMV/hNRAGE。经测序检测后,用PmeI酶切使pAdTrack-CMV/hNRAGE被线性化,然后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1用电穿孔法共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组。经PacI酶切鉴定后,用磷酸钙法转染QBI-293A细胞,包装成重组体腺病毒Ad-hNRAGE颗粒。利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中GFP报告基因的表达,观察重组腺病毒的产生,测定病毒颗粒的浓度。用Western blot检测目的基因的表达。采用MTT法检测293细胞的活力,用流式细胞术分析hNRAGE基因对293细胞周期的影响。结果成功地构建hNRAGE重组腺病毒载体。Western blot检测结果证实,hNRAGE基因可在293细胞中表达。收获病毒后,经测定病毒颗粒的浓度大约为6.5×109个/μL。转染了重组腺病毒Ad-hNRAGE的293细胞与正常细胞相比较,增殖率显著降低,G0-G1和G2-M期的细胞增多,S期的细胞明显减少。结论hNRAGE基因可能有抑制293细胞生长的作用。     

辐射调控自杀基因的腺病毒载体在胰腺癌细胞中的表达

早期生长反应基因-1(Egr-1)启动子可由电离辐射诱导,使得转导基因的表达可从时间与空间上进行调控,由此驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(TK)在胰腺癌细胞中高效表达,提高杀伤胰腺癌细胞的效率,本研究旨在观察辐射调控下的自杀基因的腺病毒载体在胰腺癌细胞中的表达。     

氟尿嘧啶与高能聚焦超声刀的结合在人回、盲肠癌裸鼠肿瘤治疗中的作用

目的 探讨化疗和物理治疗的结合在人回盲肠癌裸鼠肿瘤治疗中的作用.方法 人回盲肠癌细胞HCT-8接种到BALB/C雌性裸小鼠腹部皮下,按预期方案进行氟尿嘧啶 高能聚焦超声刀治疗.采用免疫组织化学SP法对瘤组织进行检测.结果 成功建立荷瘤小鼠模型.治疗后肿瘤体积无显著变化,局部组织出现焦化,而对照组肿瘤增长明显,无任何外观变化;且治疗后瘤组织中突变型p53蛋白的阳性率有明显下降.结论 化疗药物氟尿嘧啶与物理治疗高能聚焦超声刀的有效结合对人回盲肠癌裸鼠肿瘤的治疗有一定效果.     

辐射调控性TK基因载体在胃癌细胞中的表达

目的 利用放射敏感基因早期生长反应基因1(Egr-l)启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(TK),观察其在胃癌细胞中的表达.方法 以细菌内同源重组法构建含 TK基因的腺病毒载体pAdEgr-1-TK,转染人胃癌细胞株MGC-803,分别以0、5、7.5、10、15、20Gy剂量γ射线照射,逆转录-聚合酶链反应( RT-PCR)半定量分析,比较TK基因的mRNA表达.结果 转染后的胃癌细胞株经射线照射后其TK mRNA的表达较未照射组(56.4±1.46)%有明显提高,以10Gy最为显著(132.3±2.18)%,(P＜0.01).结论 经γ射线照射后,射线激活Egr-l启动子可引起TK基因在胃癌细胞中高效表达,为进一步研究胃癌的放化疗提供了依据.     

由Ｅｇｒ-１调控ＴＫ基因灭活胰腺癌细胞的实验研究

目的:观察对放射敏感的早期生长反应基因-1(early growth response-1,Egr-l)启动子调控单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,TK)基因是否对胰腺癌细胞的杀伤作用有增敏效应.方法:以细菌内同源重组法构建含TK基因的腺病毒载体pAdEgr-1-TK,转染人胰腺癌细胞株PC-3,60Co-γ射线照射后,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量分析各不同照射剂量组TK基因的mRNA的表达.加入前药丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV),MTT法检测其对胰腺癌细胞的杀伤作用.结果:经60Co-γ射线照射后,与对照组胰腺癌细胞(0.86±0.11)相比,前药GCV可明显提高对转染pAdEgr-1-TK胰腺癌细胞的杀伤效率(0.08±0.03)(P＜0.001).结论:由Egr-l启动子调控的TK自杀基因在γ射线作用下可以显著提高杀伤胰腺癌细胞的能力.     

人回盲肠癌荷瘤裸鼠模型的建立和氟尿嘧啶的治疗作用观察

目的：探讨化疗药物氟尿嘧啶在人回盲肠癌裸鼠肿瘤治疗中的作用。方法：将人回盲肠癌细胞HCT-8接种到BALB／C雌性裸小鼠腹部皮下。按预期方案用氟尿嘧啶进行化疗。采用免疫组化SP法对瘤组织进行检测。结果：成功建立荷瘤小鼠模型。治疗后肿瘤体积无砚显变化。而对照组肿瘤增长明显，且瘤组织中突变型：P53蛋白的阳性率有明显下降。结论：化疗药物氟尿嘧啶对人回盲肠癌裸鼠肿瘤的治疗有一定效果，可为人肠道肿瘤的治疗提供依据。     

携带Egr-1基因调控序列的TK基因的腺病毒载体的构建

目的：构建以GFP做标志基因的放射敏感基因Egr-1调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（herps simplex virus thymidine kinase，TK）的腺病毒载体。方法：以PCl-neo-Egr-1-TK（oET）为模板扩增Egr-1，插入到pAdTrack的XbaⅠ和XhoⅠ位点。构建重组质粒pAdTrack／Egr-1；与pET酶切获得TKcDNA相连，构成pAdTrack／Egr-1-TK；用PmeI酶切后与pAdEasy-1混合。应用细菌内同源重组法获得重组表达质粒pAdEgr-1-TK。结果：重组表达质粒pAdEgr-1-TK的酶切鉴定符合预期结果，感染肿瘤细胞可见绿色荧光表达。结论：通过细菌内同源重组成功构建含GFP做标志基因的pAdEgr-1．TK重组表达质粒，为研究Egr-1调控自杀基因及对肿瘤细胞进行灭活打下了基础。     

实验动物生物学特性数据化表达的规范化与数据共享

生物学特性数据化表达是实验动物标准化的内容之一,也是实验动物资源共享平台建设的重要组成部分和实现资源整合与共享的条件之一.制定实验动物资源描述规范和有关规程,对实验动物生物学特性和基本信息进行规范化和标准的整理和描述,可为科技工作者提供深入、详尽的资源信息,推动实验动物资源的建设与共享.     

辐射诱导性自杀基因对胰腺癌体内治疗效果的实验观察

目的将PC-3胰腺癌细胞种植于balb/c裸小鼠皮下,建立移植瘤模型,观察pAdEgr-1-TK注入后在射线和前药GCV下对胰腺癌的治疗作用。方法PC-3胰腺癌细胞以1×107混以0.1 ml磷酸盐缓冲液(PBS)皮下接种于balb/c裸鼠皮下,每组6只,共4组24只,待肿瘤长至约0.6 cm时,分为4组,以PC-3组作为对照,PC-3/pAdE组注射同量混以PBS的pAdEgr-1,PC-3/pAdET(不放射)和PC-3/pAdET(放射)组将纯化腺病毒pAdEgr-1-TK以1×109 pfu/ml、0.1 ml/只直接注射到治疗组肿瘤体内,1次/d,连续3 d,同时,腹腔内每日注射GCV(25 mg/kg),连续14 d,即分两次间隔48 h行剂量为10 Gy的60Co-γ射线照射,观察各组动物肿瘤生长情况,每3天测量肿瘤体积[(长径×短径2)/2],治疗结束后,处死裸鼠,取瘤体称重,并在光镜下观察肿瘤的病理结果变化。结果4组细胞接种后,balb/c裸小鼠均成瘤,成瘤潜伏期无差异,成瘤率为100%,治疗前(60Co-γ射线照射 GCV),四组动物瘤体大小无差异(P=0.824),治疗后,观察对照组肿瘤生长迅速,治疗组肿瘤生长明显减慢,体积和质量PC-3/pAdET(放射)组均明显小于其他3组(P=0.000)。结论成功建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型,体内实验证实Egr-1基因启动子在射线作用下可驱动下游TK自杀基因表达而对胰腺癌起治疗作用。